中医平肝益肾法对帕金森病P53介导的AMPK/mTOR自噬信号通路干预作用及与凋亡关系的研究

Autophagy is closely related to Parkinson's disease (PD), and the theory of smoothing the liver and tonifying the kidney is the basic treatment of PD, there is a similar and subtle relationship between autophagy "steady state" and "yin and yang balance". The main mechanism for the treatment of PD is that P53 protein activates AMPK silencing mTOR pathway to promote autophagy, maintain steady state and inhibit neuronal cell apoptosis. This project has proved that smoothing the liver and tonifying the kidney which has the effect of adjusting“yin and yang balance”can treat PD by improving the oxidative stress response, neurological immunity and apoptosis. Are there any links between them? In this study, SH-SY5Y cells induced by MPP + (in vitro) and α-synuclein transgenic mice (in vivo) were used as research targets. Some techniques are used, such as transmission electron microscopy、TUNEL、cell transfection、RTCAxCELLigence、immunofluorescence、western blotting、flow cytometry and RNAi technology. The molecular mechanism of P53-mediated AMPK / mTOR signaling pathway in preventing and treating PD of smoothing the liver and tonifying the kidney and its relationship with autophagy and apoptosis were explored in a wide range of molecular, cellular, tissue and animal levels, which provides a new theoretical basis for PD treatment.

自噬与帕金森病（PD）密切相关，而平肝益肾法是中医临床治疗PD的基本治法，自噬的“稳态”与中医的“阴阳平衡”存在着相似而微妙的关系。P53蛋白活化AMPK沉默mTOR通路从而促进自噬，保持稳态，抑制神经元细胞凋亡为治疗PD的主要机理；本项目已证明具有调整阴阳平衡的平肝益肾法可通过改善氧化应激反应、神经免疫及细胞凋亡而改善PD。两者是否存在必然联系？因此，本研究将分别以α-synuclein转基因小鼠（体内）和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞（体外）为研究对象，采用透射电镜、TUNEL法、细胞转染、实时无标记细胞分析、免疫荧光、免疫印迹法、流式细胞术、RNAi技术等手段，从分子、细胞、组织及动物整体水平多方面探讨P53介导的AMPK/mTOR信号通路在平肝益肾法防治PD中的作用及与自噬和凋亡关系的分子机制，为PD治疗提供新的理论依据。

项目背景及主要研究内容：自噬与帕金森病（PD）密切相关，而平肝益肾法是中医临床治疗PD的基本治法，基于平肝益肾法理论衍生出拜颤停复方（BCT）。P53蛋白活化AMPK沉默mTOR通路从而促进自噬而保持稳态，抑制神经元细胞凋亡为治疗PD的主要机理；本项目已证明具有调整阴阳平衡的平肝益肾法可通过改善氧化应激反应、神经免疫及细胞凋亡而改善PD。本研究以转基因小鼠（体内）和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞（体外）为研究对象，采用透射电镜、TUNEL法、细胞转染等手段，从分子、细胞、组织及动物整体水平多方面探讨P53介导的AMPK/mTOR信号通路在平肝益肾法防治PD中的作用及与自噬和凋亡关系的分子机制。重要结果及关键数据：1.神经保护作用初步药效学研究：BCT能够改善小鼠行为学异常、提高脑内多巴胺水平、降低神经元损伤、提高神经细胞存活率实现其神经保护作用。2.自噬与凋亡影响研究：BCT通过上调自噬蛋白BCL-2、LC3B、Beclin，下调凋亡蛋白BAX、Caspase-3、AMPK、mTOR、P53的方式实现其促进自噬抑制凋亡的神经保护作用。3.蛋白质磷酸化修饰层面的自噬与凋亡影响研究：BCT通过上调PAK、NMDAR、PDE水平，下调CaN、L1CAM、Raf、PP2B、TH、AF6、HCN2/4、VSSC的水平，从而干预PD模型小鼠与自噬凋亡有关的六条重要生物学途径：“L1CAM→CaN（CaN→BAX↔Caspase）↔PAK（PAK→P53↔AMPK↔mTOR）→Axon guidance”、“CaN→Raf（Raf↔LC3B）→Long-term potentiation”、“ PP2B→Glutamatergic synapse”、“TH↔VSSC（VSSC↔P53）→PP2B↔NMDAR→Dopaminergic synapse”、“HCN2/4↔Raf→AF6→cAMP signaling pathway”、“PDE→Olfactory transduction”。不同的磷酸化蛋白以其不同的作用趋向，推测能够促进神经发育成熟、提高神经突触的传递效率和学习记忆能力、减轻患者肢体运动障碍及震颤症状。这可能是BCT治疗PD的重要靶点和生物学基础之一。科学意义：平肝益肾法可以介导P53蛋白活化AMPK抑制mTOR通路，增强自噬，抑制神经元细胞凋亡而治疗PD。