产番茄红素重组大肠杆菌代谢途径的定向进化与转录组学研究

代谢工程是目前微生物菌种改良最有效的手段。随着各种组学和计算机分析技术的发展，代谢工程已由靶代谢工程时代进入了一个全新的基于系统生物学的系统代谢工程。因此研究代谢工程新技术具有重要的科学意义和实用价值。为此，我们计划在原有工作基础上，对已确定的重组大肠杆菌产番茄红素代谢途径中关键酶进行定向进化，以实现代谢途径的定向进化，并利用比较转录组学研究其代谢调控机制，提出新的途径改造的策略以进一步优化代谢途径。项目创新性主要体现在代谢途径的定向进化和比较转录组学研究两方面。项目属于代谢工程前沿课题，项目研究不仅能推动代谢工程学科的发展，又将能促进番茄红素的研发，推动我国工业生物技术产业的升级和产品的更新换代。

利用易错PCR技术对番茄红素合成途径中关键基因dxs进行随机突变，获得了2个番茄红素产量分别提高了17%和20%的正突变基因，测序分析了突变基因碱基和氨基酸突变位点；利用启动子置换技术，将dxs基因天然启动子置换成T5启动子，获得了产番茄红素的出发菌株E. coli BW25113(ΔgdhA ΔaceE, PT5-dxs)；利用转录机制工程技术，对大肠杆菌全局调控转录因子δ38因子rpoS基因进行随机突变，分别获得了1个番茄红素产量提高了36%的突变因子，其7个碱基发生了改变，同时引起了7个氨基酸的突变；利用三氯生诱导染色体进化技术构建了一株无质粒无抗生素筛选标记的产番茄红素超级工程菌E. coli CBW12241（染色体进化菌），经培养基优化后，可产番茄红素30.5 mg/gDCW，为国际领先水平。比较研究了染色体进化菌E. coli CBW12241与出发菌E. coli BW25113(pAC-LYC04)的转录组学，结果揭示进化菌E. coli CBW12241导致27个基因表达水平上调、49个基因表达水平下调，番茄红素合成与组氨酸合成、乙醛酸旁路、醌合成、NADPH平衡和细胞膜组成有关。根据转录组学结果，我们对进化菌E. coli CBW12241的代谢途径进行了进一步优化，得到得到E. coli CBW12241 (ΔiclR, PT5-appY)，其番茄红素含量提高了15.4%，摇床发酵可产番茄红素33.43 mg/g DCW，5L罐高密度发酵可产番茄红素浓度为359mg/L，达到了国际领先水平。共培养硕士生7名、博士生3名。已发表了5篇论文，其中SCI收录论文3篇，并还有1篇SCI收录期刊论文已返回修改稿；申请了1项发明专利。