基于代谢组学的番茄果实成熟关键转录因子调控营养素合成的分子机制研究

Fruit presents its unique color, aromas, taste and nutrients during its ripening and is an important source of plant nutrients needed by human. The fruit ripening is regulated by the key transcription factors, which affect the synthesis of nutrients at the same time. For Rin, Nor, Cnr, TAG1, AP2 and TDR4, silencing or mutation of any single transcription factor led to obtain the fruit with no ripening in tomato fruit, but the regulation mechanism of nutrients by these transcription factors is not clear. In this project, we analyzed the differences of the global metabolites between the 6 transcription factors mutants or silencing and the control samples by using the metabolic profiling. On this basis, the Real-time PCR was used to analysis the key points of the candidate difference nutrients metabolism pathway, and through the EMSA (electrophoresis mobility shift assay) to verify the results the in vitro. The results could effectively resolve the regulation mechanism of fruit nutrients mediated by these key transcriptions factors in tomato fruit, and enrich the regulation theory of fruit nutrients synthesis in future.

果实在成熟过程中呈现其特有的色、香、味和营养，是人类所需植物营养素的重要来源。果实成熟过程受到关键转录因子的调控，该基因在影响果实成熟的同时影响了营养素的合成。番茄中Rin、Nor、Cnr、TAG1、 AP2 和TDR4单个转录因子沉默或突变均导致了果实的不成熟，但调控的营养素种类和机制不清。本项目利用代谢组学的方法分析上述6个转录因子突变体或沉默样本与对照样品之间的全局代谢物差异，筛选受其显著影响的果实营养素。在此基础上，利用Real-time PCR分析转录因子调控营养素代谢途径关键点，并通过凝胶阻滞实验进行体外验证。研究结果能有效解析成熟关键转录因子调控番茄果实营养素的合成机理，丰富果实营养素合成调控理论。

本项目对番茄果实成熟中的几种关键转录因子对代谢组分的影响及其分子机制进行了研究。采用生物技术，成功培育获得了转录因子SlNOR基因编辑番茄、 SlMADS1基因编辑番茄、TAG1基因沉默番茄、AP2基因沉默番茄和TDR4基因沉默番茄果实作为试验材料。采用LC-MS及RNA-seq技术对各处理组番茄和野生型番茄进行了代谢组分析和转录组分析，筛选出了各对比组的差异代谢物和差异表达基因，采用KEGG富集分析筛选出受到显著影响的代谢通路。文中的差异代谢物和差异基因均指某处理组与野生型番茄的对比结果。经过主成分分析，各处理组番茄与野生型番茄的代谢物轮廓得到很好地区分。对于SlNOR基因编辑番茄，其差异代谢产物包括氨基酸类、核苷酸类、黄酮酚酸类及有机酸等物质；其差异基因在次生代谢产物合成、乙烯合成与信号转导、类胡萝卜素生物合成、黄酮类合成代谢、糖类和淀粉合成、氨基酸代谢等途径中显著富集。 SlMADS1基因编辑番茄的差异物主要包括氨基酸类、糖类、核苷酸、生物碱以及黄酮酚酸等；其差异基因主要参与了次级代谢产物的合成、碳代谢途径以及糖酵解途径。对于TDR4基因沉默番茄，其差异代谢物质主要为氨基酸、有机酸、番茄碱和酚类物质；其差异基因与次生代谢产物合成、芳香族氨基酸代谢、类胡萝卜素代谢具有较高的相关性。TAG1基因沉默番茄的差异代谢物主要包括氨基酸类、酚酸类及番茄碱；其差异基因与次生代谢产物合成、胡萝卜素合成、脂肪酸降解及氨基酸代谢相关性较高。AP2基因沉默番茄的差异代谢物主要为氨基酸类、糖类、核苷酸、生物碱以及有机酸等，这些物质参与的代谢途径包括次生产物代谢、氨基酸代谢、嘌呤代谢、糖类代谢及生物碱合成等。通过凝胶阻滞实验（EMSA）证明了NOR蛋白能结合成熟相关靶基因如乙烯生物合成基因SlACS2,色素合成相关基因SLGagpps2的启动子区域，证明其作为转录因子可以调控果实成熟中的代谢相关过程。本课题初步明确了番茄中几种关键转录因子对代谢成分的调控作用，为深入研究其机理奠定了基础，对番茄品质改良具有一定意义。