中药对“正虚”“瘀毒”证型骨髓增生异常综合征组蛋白乙酰化机制差异性表达的干预研究

It is widely known that histone modification is the control mechanism of the fate of cell differentiation, highly according with the pathological features of Myelodysplastic syndrome(MDS)cells differentiation disorders. “Histone acetylation – transcription factor - transcriptional gene expression- apoptosis "mechanism research has become one of the research directions of MDS epigenetics. Based on the previous MDS clinical studies of traditional Chinese medicine (TCM), TCM syndrome type and the bidirectional apoptosis mechanism of bone marrow cells of MDS、histone acetylation modification function studies and so on . We will use MDS bone marrow cells cultured in vitro, immunoprecipitation (IP), Realtime-PCR, Western blot and other experimental methods that intend to further solve the following some scientific problems:1. Inerpret HDACs/TLR2/GATA1histone acetylation involving in signaling pathways mediates epigenetic mechanism of MDS;2.Analyze the histone acetylation features of different TCM syndromes of “Vital Qi Deficiency and Stasis Toxin” ,and confirm differential of expression. ”histoneacetylation – transcriptionfactor - transcriptional gene expression - apoptosis ”mechanism " hypothesis;3. Confirm composition of core in Chinese herbal medicine about effective support vital qi which will effect on the low risk MDS related signal pathway, further clarify inherent efficacy mechanism ,and provide a new theoretical basis for the Chinese medicine is effective in the treatment of MDS.

组蛋白修饰作为公认的细胞分化命运控制机制与MDS骨髓细胞分化障碍特点高度吻合。“组蛋白乙酰化-转录因子-转录基因表达-细胞凋亡”机制研究成为MDS表观遗传学研究方向之一。课题组结合既往MDS中医药临床研究、中医证型与其骨髓细胞双向凋亡机制研究、MDS组蛋白乙酰化修饰作用研究等前期工作，采用MDS骨髓细胞体外培养、免疫沉淀技术（IP）、Realtime-PCR、westernblot等实验方法，拟解决以下几个科学问题： 1.阐释HDACs/GATA1/TLR2相关信号通路介导的MDS表观遗传学机制；2.分析不同“正虚”、“瘀毒”中医证型MDS组蛋白乙酰化的特征，证实“MDS不同中医证型的‘组蛋白乙酰化-转录-基因表达-细胞凋亡’机制的表达差异性”假说；3.证实有效扶正中药核心组方对低危型MDS相关信号通路的调控作用，进一步阐明其疗效的内在机理，为中医药有效治疗MDS提供新的理论依据。

组蛋白乙酰化机制差异性表达是MDS“正虚”、“瘀毒”证型的重要发病机制，有效扶正中药核心组方能够调控组蛋白乙酰化机制HDACs/ GATA-1/TLR2相关信号通路发挥治疗作用。本研究根据MDS的诊断标准和国际预后评分系统，收集MDS患者40例，其中低危组20例，高危组20例，另收集正常对照组骨髓标本10例；使用流式细胞仪对BMMNC细胞进行凋亡检测，采用western blot和RT-PCR检测HADC1、GATA-1和TLR2的蛋白和mRNA水平；使用MTT法测定对不同危度MDS干预的药物浓度和干预后细胞增殖水平，并在有效扶正核心组方中药醇提物、有效祛邪组方中药醇提物以及SAHA、As2S2干预后检测细胞凋亡、HADC1、GATA-1和TLR2的蛋白和mRNA水平进行对比。结果：1、MDS患者BMMNCs中HDAC1、TLR2mRNA及蛋白表达水平高于正常人；2、采用扶正、祛邪药物对正虚型和瘀毒型MDS患者BMMNCs中HDAC1、TLR2mRNA表达进行干预，正虚型MDS患者扶正组、祛邪组、阳性对照组的HDAC1、TLR2mRNA表达水平低于阴性对照组；正虚型MDS HDAC1蛋白水平的下降程度祛邪组和SAHA组、雄黄组比阴性对照组低，而扶正组无统计学差异。扶正药与祛邪药相比，TLR2、HDAC1蛋白水平的下降程度未见明显统计学差异；在正虚组中，与阴性对照组相比，各干预组细胞总凋亡率升高；与阴性对照组相比，瘀毒型MDS患者祛邪组和扶正组HDAC1、TLR2mRNA表达水平均下降；与阴性对照组相比，瘀毒型MDS祛邪组和扶正组HDAC1、TLR2蛋白水平均下降；在瘀毒组中，与阴性对照组相比，各干预组细胞总凋亡率升高有显著统计学差异。3、MDS患者GATA-1 mRNA和蛋白水平均低于正常人，HDAC1mRNA和蛋白水平均高于正常人，正虚型患者与瘀毒型患者间未发现明显差异；经SAHA、雄黄干预后HADC1水平下降，同时GATA-1 水平显著上升，扶正、祛邪中药能上调各组GATA-1表达水平，下调HADC1表达水平。结论：“组蛋白乙酰化-转录因子-细胞凋亡”是MDS发病的主要机制；有效扶正核心组方通过对低危型MDS细胞表观遗传学的调控（组蛋白乙酰化），影响GATA-1和TLR2表达水平，最终决定细胞凋亡，进一步阐明了中药有效治疗MDS的分子生物学机制。