氧化葡萄糖酸杆菌短链脱氢酶结构-功能解析及其生物催化应用基础研究

Gluconobacter oxydans, which developed the oxidative fenmentation, has been widely used in oxidative catalyzation. We have determined a series of new enzymes in G.oxydans as well as about ninety reactions, and several were successfully used in industry field. Based on these researches, both theory and application value of the short-chain dehydrogenases/reductases (SDR) are of great importance. Herein, this proposal would interpret its biological functions by designing to analyze and forecast the 13 SDR genes and deeply explore their regio- and stereo-selectivity which also help to discover the new types of catalyzation and new applications.The SDR superfamily involve in many types of catalytic reaction, the relationship research on protein structure and enzymatic function is the most forward field. Protein crystallization, structural analysis, rational design and direct mutagenesis would provide clues to explore their inner relations and give comprehensive understanding on SDR in G. oxydans. Artificial enzymes which have extended substrate acceptance and coenzyme preference can be further obtained. Finally , 3-5 ideal enzymes and 1 or 2 strains can be provided for synthesis or seperation of chiral alcohol in industrial application area.

氧化葡萄糖酸杆菌是氧化发酵的创立菌和氧化催化应用最广泛的微生物之一，申请人已揭示该菌若干新酶及其催化的90余种反应（部分成功应用）。前期研究基础表明，对其胞内所含最多成员的短链脱氢酶（SDR）的深入研究在学术和应用方面都具有重要意义。本项目拟对13条SDR基因进行分析及功能预测，结合对其生物催化特征的认知，进一步挖掘其区域选择性和立体选择性，获得可应用于重要生物催化反应的新酶，发掘新反应，揭示其胞内氧化还原的生物学功能。SDR家族庞大，参与催化的反应类型众多，其构效关系研究立于当前学术前沿。申请人拟采用蛋白结晶技术结合计算机动力学模拟，验证SDR功能位点或motif，揭示酶催化共性机制，深入解析SDR的结构与功能。借助于理性设计拓宽底物选择性、提高立体选择性、改进辅酶偏好性，为工业生物催化应用提供3-5种理想的新酶，构建1-2株重组菌作为手性醇等重要化合物拆分或合成的生物催化剂。

氧化葡萄糖酸杆菌是氧化发酵的创立菌和氧化催化应用最广泛的微生物之一。本项目基于基因组挖掘技术和生物信息学分析方法，获得了12条候选的氧化还原酶基因。以多种酮、酮酯和醛类化合物为底物进行筛选，确定其中的7个酶分子表现出羰基还原活性和不同的底物特异性。其中，羰基还原酶Gox0525对OPBE具有最好的立体选择性，专一性生成(S)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，对映体过量大于99%；与其他酶相比，产率最高，达到了93.1%。针对NADPH依赖的羰基还原酶Gox0525，获得了Gox0525的晶体结构数据，获得了可利用NADH依赖的突变酶Gox0525 N37P。N37P突变酶在NADH为辅酶的作用下催化效率非常高，达到了1231.5 s-1 mM-1，且对OPBE还原的立体选择性未发生改变，生成(S)-HPBE，且e.e>99%。. 结合计算机动力学模拟，探究酶的结构-功能关系、 酶-底物相互识别与作用模式、底物依赖的立体选择性分子机制。成功拓宽了 Gox2036的催化应用，实现了对已有酶资源催化功能的深度挖掘。 以 3,5-双三氟甲基苯乙酮为模式底物，筛选到酶活显著提高的三点突变株 W193A/I143A/Y149L 和W193A/I143A/I187P，将催化 BTAP 比活提高到 0.79 U/mg 和 0.91 U/mg。利用重组 W193A/I143A/I187P E. coli BL21 作为催化剂，实现了 1000 mM BTAP 的完全转化，产物(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇分析得率 94%,ee >99%。 获得W193L、 W193V 和 W193I 三个突变株，将产物 (R)-4-苯基-2-羟基丁酸乙酯ee 值从野生型的 43.2%提高到100%，且催化比活大幅提高；双点突变 C93V/Y149A 将产物选择性逆转到79%（生成 S-HPBE)。最后，重组菌W193L E. coli BL21实现了500 mM OPBE有效转化，且专一生成 R-HPBE（ee >99.5%）。 . 通过本项目的研究，共发表论文16 篇SCI 收录论文，1篇会议论文，申请发明专利6项，其中已授权专利5 项，实审1项。获得国家技术发明二等奖1项。培养研究生12名，其中博士研究生7名，硕士研究生5名。主办国际会议1次，参加国际国内会议2次。