一个水稻油菜素内酯相关的类病斑突变体的基因克隆及功能分析

Brassinosteroid (BR) signal pathway has been studied in rice mainly focused on the leaf erectness related agronomy trait. Till now, how the components of BR pathway involved in the disease defense remains elusive in rice. In our preliminary work, a lesion mimic mutant with enhanced brassinosteroids response, obtained from Dongjin mutants' collection, was designated as lmbr (lesion mimic and BR related). Compared to wild-type, the lmbr mutant displayed enhanced resistance to rice blast inoculation and increased ROS generation after chitin treatment. Therefore, the overall aim of this proposal is to understanding the molecular mechanism underling lmbr mediated lesion mimic formation and the enhanced BR sensitivity. To achieve this, firstly, we will clone lmbr gene via map-based cloning method. Next, Lmbr interacting protein, namely LIPs, will be screened out from yeast two-hybrid assay and the functional analysis of LIPs will be carried out in both RNAi and OX rice plants. Thirdly, the RNA-seq approach will be performed to find out the lmbr modulated transcriptome. Finally, we will compare and analysis the data from yeast two-hybrid and RNA-seq to unravel the signals networks of defense-related genes and BR signal pathway genes regulated by Lmbr. The outcome will provide new strategy for crop disease control.

水稻中的油菜素内酯(BR)信号途径主要集中在叶片直立性等农艺形状的研究上，但是水稻中BR信号途径的成员如何参与到植物抗病的研究仍是空白。在前期工作中，我们从Dongjing突变体库中得到的一个BR应答增强的的水稻类病斑突变体，命名为lmbr。与野生型相比，接种稻瘟菌后lmbr突变体具有更强抗病性；几丁质处理后lmbr突变体产生更强的活性氧迸发。基于此，本项目将研究Lmbr调控水稻水稻类病斑形成及BR信号途径的的分子机理。首先，将通过图位克隆法克隆Lmbr基因；然后，通过酵母双杂交手段筛选Lmbr互作水稻蛋白LIPs并在LIPs转基因水稻分析其功能；再次，使用RNA-seq鉴定lmbr的调控谱；最后，综合以上数据，解析lmbr调控水稻抗病和BR途径的信号网络。研究结果将为农作物病害防控策略提供新思路。

类病斑突变体是研究植物细胞程序性死亡的优良材料，本项目对水稻中一个新的类病斑突变体dj-lm（dongjin lesion mimic）开展了突变体形态与抗性特征、dj-lm基因的遗传分析与精细定位、候选基因的互补检测和功能分析等多方面的研究。抗病性鉴定表明，dj-lm突变体增强了对稻瘟病菌与白叶枯病菌的抗性；遗传分析结果揭示dj-lm类病斑表型受一对隐性核基因控制，通过图位克隆及候选基因序列分析发现在DRP1E基因的编码区第1226位点碱基发生由A变为T的突变，导致其编码蛋白的第409位点氨基酸由E突变为V，互补实验证实DRP1E的点突变为类病斑产生的原因。进一步对DRP1E进行了功能研究，酵母双杂交实验显示，DRP1E蛋白不仅可以自我互作，还可与高度同源的DRP1C及DRP1D互作；E409V点突变既影响DRP1E蛋白自我互作，E409V突变型蛋白失去了与DRP1C及DRP1D互作的能力；非变性蛋白PAGE结果表明E409V也影响了该蛋白高分子复合体的形成。体外GTP酶活检测表明E409V点突变降低了DRP1E蛋白GTP酶催化活性；亚细胞定位分析显示野生型OsDRP1E蛋白定位于线粒体，而E409V突变型蛋白失去了线粒体定位功能，导致突变体dj-lm中线粒体的脊更大、更膨胀、且其溶质密度下降。利用细胞色素c抗体检测其蛋白水平，胞质中细胞色素c在dj-lm突变体中含量明显高于野生型DJ，这可能是假病斑突变体表型发生的最主要因素之一。本项目的研究结果为深入了解水稻线粒体参与调控的程序性细胞死亡分子机制、抗病机理与信号传导提供了积极指导作用，同时可为选育水稻抗病新材料提供分子依据与遗传材料。