一种新的益生菌LGG效应蛋白通过MDP-NOD2调节肠稳态保护克罗恩病的机制研究

Crohn's disease (CD) is a chronic inflammatory disorder of the gastrointestinal tract with no effective therapy, which is believed to result from the disturbance of intestinal homeostasis. Previously, we found a novel secreted protein from LGG, named HM0539, with a significant protective effect against TNBS-induced colitis in mice, but the precise mechanism is unclear. Further study suggested that the product of HM0539-hydrolysed peptidoglycan was sufficient for protection. ANTS analysis showed that the major fragment of HM0539-hydrolysed peptidoglycan is MDP, a defined ligand of NOD2. Given that MDP-NOD2 signaling plays a critical role in modulating gut homeostasis and its disturbance is involved in the pathogenesis of CD, we speculated that the protective mechanism of HM0539 against CD may be driven by initiation of MDP-NOD2-mediated gut homeostasis. The aim of this proposal is to verify this hypothesis. We will first create an enzymatic mutant of HM0539, to determine whether MDP is the major fragment of HM0539-hydrolysed peptidoglycan, and whether MDP is required for HM0539-mediated protective effect. Then, we will generate a NOD2 frameshift mutant mice with MDP-sensing defect, to investigate whether MDP-NOD2-mediated gut homeostasis is involved in HM0539-mediated protective role. The completion of this proposal will provide novel directions for clinical treatment of CD.

克罗恩病（CD）是一种临床常见的肠道慢性炎症反应性疾病，肠稳态失衡是导致其发病的关键，目前缺少有效治疗方法。我们前期发现一种新的鼠李糖乳杆菌LGG效应蛋白HM0539能有效保护小鼠CD，但具体机制不明。最近，我们发现HM0539可水解肽聚糖，并通过其水解产物保护CD。随后分析表明HM0539水解肽聚糖的主要产物是MDP（一种NOD2配体）。鉴于MDP-NOD2通路调节肠稳态的重要性及该通路受损在CD发病中的关键性，我们提出假说：HM0539通过水解肠道中的肽聚糖产生MDP，激活NOD2维持肠稳态以保护CD。本研究拟先构建和利用肽聚糖水解酶活性突变的HM0539，明确水解肽聚糖产生MDP是介导HM0539保护CD的关键；然后利用识别MDP缺陷的NOD2移码突变小鼠，阐明HM0539通过MDP-NOD2通路调节肠稳态保护CD的机制。本研究可为开发CD有效防治方法提供新思路，并有望实现临床转化。

肠道稳态失衡是介导克罗恩病（CD）发病的重要原因，调节和维持肠道稳态是治疗CD并防止其复发的关键。益生菌的效应分子因具有调节肠道稳态的重要作用而备受关注。在前期研究中，我们发现一种新的LGG效应分子 LPH可有效保护小鼠CD。为全面了解LPH治疗CD的可行性，本项目深入阐明LPH保护CD的机制。.我们按计划完成了研究，并根据前期研究结果，原有研究设计上进行了拓展。主要完成的研究内容包括： .1．采用生物信息学结合点突变蛋白实验，及动物模型，证明了LPH是一种双功能肽聚糖水解酶，具有N-Acetyl-β-D-muramidase 和DL-endopeptidase活性，可水解大分子肽聚糖产生MDP。.2．采用NOD2基因敲除小鼠，明确了LPH通过NOD2信号通路，调节肠稳态保护肠炎。.3．从生物信息、体内外实验及人群标本多个层面，阐明了肠道菌群来源的DL-内肽酶是决定肠道中NOD2配体的关键酶。.4．通过大规模宏基因（11个队列，2324样本）、靶向代谢组（70样本）、转录组（4个队列，732样本）分析确证了DL-内肽酶减少-NOD2配体减少-NOD2通路激活受损与CD发病及严重程度相关。.5．从人体粪便中筛选出1种新的DL-内肽酶，并证明其保护肠炎的效果。. 本研究阐明了一种传统益生菌作用的分子机制，并首次揭示了肠道菌群影响NOD2激活在CD发病中的重要作用，具有重要转化潜力。