阻断Galectin-9/TIM-3途径促进CIK细胞向白血病微小残留病灶局部迁移

白血病微小残留病灶（MRD）是导致白血病复发的根源，细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）现已用于其治疗，但体内疗效与体外高抗瘤活性相比不尽如人意，因此如何进一步提高CIK细胞疗效具有重要意义。.本课题拟建立小鼠MRD模型，观察CIK细胞在体内迁移及组织器官的分布特征，证实CIK细胞迁移进入MRD局部数量减少是影响CIK细胞体内疗效的重要原因；检测骨髓微血管内皮细胞(MEC)表达的半乳凝素-9(Galectin-9)配体和CIK细胞的T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)受体的表达水平，验证MEC诱导CIK细胞凋亡的作用，证实Galectin-9/TIM-3途径是影响CIK细胞迁移进入MRD的关键机制；进而阻断该配受体作用，观察能否促进CIK细胞向MRD局部迁移。本项目的完成有望提高CIK细胞体内疗效，减少白血病复发，并对提高肿瘤过继免疫治疗疗效提供新的思路。

目的：拟对内皮细胞Gal-9和CIK细胞的TIM3表达特征进行研究，探讨DC-CIK细胞表面表达的Tim-3受体是否会影响其的迁移分布。方法：RT-PCR方法检测CIK细胞表达TIM-3； MTT法检测TIM-3阻断前后DC-CIK细胞杀伤作用。构建携带Galectin-9和Galectin-9 shRNA的在MEC特异表达的腺病毒载体，分析MEC Galectin-9水平变化对CIK细胞凋亡的影响。检测Tim-3阻断前后DC-CIK细胞在体外跨肿瘤内皮细胞迁移能力的变化和DC-CIK细胞在K562荷瘤裸鼠体内向肿瘤局灶迁移数量的变化，并观察对肿瘤的疗效。结果：AL患者骨髓及外周血原代白血病细胞表达Gal-9与正常对照组表达表达差异具有统计学意义（P<0.05）。对EAHY926细胞检测发现，细胞内高表达Gal-9：92.67±2.33（%）；细胞膜低表达Gal-9：0.25±0.11（%）。CIK细胞群内CD3+CD56+细胞平均百分比为(22.87±3.98)%。当DC-CIK细胞与HL60细胞及K562细胞的比例在20:1，10:1时， DC-CIK细胞对K562细胞的杀伤作用要强于对HL60细胞的杀伤作用。DC-CIK细胞对K562细胞杀伤呈浓度依赖性。将TIM3阻断前后的DC-CIK细胞与K562细胞在5:1与2.5:1时的杀伤率分别为32.31%、36.92%、16.74%、39.6%。DC-CIK细胞在效靶比在2.5:1时，阻断作用显著增强。用transwell发现Tim-3阻断后DC-CIK细胞跨内皮1h迁移率由38.16%增加至52.66%（P<0.001）。体内分布实验发现：DC-CIK细胞在荷K562皮下瘤裸鼠体内各脏器分布水平从高到低依次如下：肾>肝>肠>脾>肺>瘤，肿瘤局灶的DC-CIK细胞很少，阻断Tim-3受体后到达肿瘤局灶的DC-CIK细胞较前增加（P<0.01），另外阻断Tim-3受体后到达骨髓的DC-CIK细胞也较前增加。每周一次DC-CIK细胞输注可以抑制裸鼠K562皮下瘤的生长；并且阻断Tim-3受体的DC-CIK细胞输注可以延长荷瘤小鼠的生存期（P<0.05）。结论：阻断Tim-3受体表达后可以促进其跨肿瘤内皮迁移和向肿瘤局灶迁移，并可以延长荷瘤小鼠的生存期，这可能是改善CIK细胞过继免疫治疗疗效的一种有效方法。