芳香新塔花总黄酮抗心肌缺血作用的线粒体机制研究

心肌缺血是由于冠状动脉功能性或器质性病变导致冠脉供血和心肌需求之间不平衡所致的心肌损害，其发病机制尚未完全阐明，多数学者认为主要与氧自由基、细胞内Ca2+超载以及心肌细胞凋亡有关。芳香新塔花具有强心利湿，理气化痰，消炎散结之功能，维吾尔医和哈萨克医用于治疗高血压及心肌缺血症。前期研究证实芳香新塔花总黄酮（Z.clinopodioides flavonoids，ZCF）对垂体后叶素致心肌缺血大鼠和急性实验性心肌缺血犬有明显的保护作用，能提高心肌细胞抗氧化能力，对心肌细胞缺氧-复氧具有保护作用。本项目在明确芳香新塔花主要药效物质的基础上，采用预防给药和复灌初期治疗给药方式，分别在在体心脏、离体心脏、分离细胞和分离线粒体模型上，观察ZCF的心肌保护作用，阐明其线粒体相关机制；明确线粒体相关通道/孔道在ZCF心肌保护中的作用、相互关系及上下游可能存在的机制，为ZCF临床应用提供新的思路和方法。

芳香新塔花为维吾尔和哈萨克医习用药材，前期已证实其总黄酮(ZCF)通过线粒体途径发挥抗心肌缺血作用。本项目进一步开展如下研究：1.应用Langendorff离体心脏模型，观察了ZCF对心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用，表明ZCF可促进CF、HR 、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmin等心功能各指标的恢复，但高剂量组作用较弱，尤其在复灌后期更为明显，推测较高剂量对心脏产生毒性有关；与I/R组比较，ZCF各剂量组心肌组织MDA含量均有降低，SOD活性显著升高，变化趋势与剂量呈相关性；与I/R组比较，ZCF可浓度依赖性抑制I/R损伤大鼠心肌组织中CK和LDH活性的降低。2.采用在体结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支法，观察ZCF对大鼠I/R损伤的保护作用及可能机制。与模型组相比，ZCF各剂量预防给药组均可明显减少大鼠心肌缺血梗死面积；再灌注末，心肌SOD活性随ZCF给药组剂量增加而增加， MDA浓度随ZCF给药组剂量增加而降低。3. 探讨了H9c2(2-1)心肌细胞氧化损伤后ZCF的保护作用。表明ZCF能显著抑制H2O2所致的H9c2心肌细胞超微量Na+, K+-ATPase 活性及ATP含量的降低；ZCF预处理心肌细胞可影响线粒体膜电位，减少线粒体膜电位损伤，对心肌细胞起明显的保护作用；ZCF使细胞内Ca2+荧光染色强度均显著减小，呈剂量依赖性，提示ZCF对细胞内钙超载引起的细胞凋亡有明显的保护作用。4.建立H9c2(2-1)心肌细胞氧化损伤模型，利用线粒体ATP敏感性钾离子（mitoKATP）阻断剂5-HD以及线粒体钙单向转运体（MCU）激动剂精胺，通过检测线粒体膜电位的变化，探讨mitoKATP及MCU是否参与了ZCF对缺血再灌注心肌的保护作用。表明给药浓度为100μg/ml时，治疗组Ratio值均有高于模型组的趋势，细胞内线粒体膜电位增高，但并未见显著性差异(P>0.05)； 阻断组与治疗组之间也未显示出显著性差异(P>0.05)。提示ZCF预处理心肌细胞，可能影响线粒体膜电位，减少膜电位损伤，从而保护心肌细胞，但其保护作用可能不是通过促进线粒体K离子通道的开放或抑制线粒体Ca2+离子通道的开放获得。荧光显微镜观察结果可见治疗组细胞仍存在较多的JC-1单体（绿色荧光），提示线粒体膜电位较低，而阻断组与治疗组之间无明显差别，与上述结果相一致。