低温诱导下光温敏雄性不育小麦BS366育性相关miRNA分离和功能研究

MicroRNA（miRNA）是近年来发现的一类非编码的内源性小分子RNA，是真核生物基因表达的一类负调控因子，主要通过转录后调控来影响植物形态发生、发育过程以及环境适应能力。本研究以小麦光温敏雄性不育系BS366为实验材料，在人工控制环境下通过不同温度处理，在育性敏感时期分期剥取花药并提取RNA，通过Solexa高通量测序技术测定雄蕊组织中的miRNA分子并进行靶基因的验证，结合已有Affymetrix芯片、细胞组织学等结果进行光温敏不育候选miRNA基因的筛选和鉴定，同时克隆全长miRNA基因，并通过miRNA原位杂交、转基因模式植物拟南芥等方法进行功能验证，旨在初步阐明低温胁迫导致雄性不育发生的分子机制，明确关键miRNA以及其靶基因与雄性不育的关系，为建立和完善小麦光温敏雄性不育分子遗传调控网络模型提供理论依据。同时，也为我国二系杂交小麦应用体系的进一步完善和利用奠定理论基础。

应用小麦光温敏雄性不育系生产杂交种的二系法，已经成为国内外小麦杂种优势利用的主要途径。小麦光温敏雄性不育系是二系杂交小麦技术的核心，但目前对该类不育系的遗传机制、败育分子机理研究仍处于初级阶段。本研究以小麦光温敏骨干不育系BS366为实验材料，在人工控制环境下通过不同温度处理，在育性敏感时期分期剥取花药，基于对小麦重要调节因子small RNA的研究，探求小麦光温敏雄性不育的机理。通过筛选不育系BS366与雄性不育相关的small RNA，克隆了与小麦雄性不育密切相关的4个miRNA前体及其调控的靶基因。发现调控靶基因ARF的tasiRNA-ARF 和miRNA167 家族受低温胁迫影响，对ARF基因表达具有一定的抑制作用，推测异常表达的tasiRNA-ARF 和miRNA167 可能与BS366 的雄性不育相关。对参与小麦生长素调控的TamiR167a进行了研究，克隆了与其互作的靶基因TaARF6和TaARF8基因。测定BS366花药组织中内源生长素含量结果表明，随着花药的不断发育，其内源生长素的含量在不断降低。初步构建了生长素参与调控小麦雄性不育的调控通路，该过程受到miR167家族的直接调控，被调控的ARF基因又能参与到其他调控通路中，例如茉莉酸合成调控通路等，可见小麦育性调控是多途径共同参与的复杂过程。同时细胞学败育特征研究表明，在不育条件下，BS366成膜体微丝表现异常，细胞板上胼胝质积累不足、不致密，成膜体内部微丝方向凌乱，当连接二分体的细胞骨架断开以后，二分体难以粘连在一起而解体，造成雄性不育。对小麦内源茉莉酸合成通路关键基因TaOPR2进行了功能初步验证，转TaOPR2基因的拟南芥突变体opr3能够恢复育性；亚细胞定位结果显示，该基因定位在过氧化物酶体上，编码蛋白具有分解OPDA的酶活性。而且TaOPR2能够对多种生物和非生物胁迫产生响应，该基因不但参与了小麦内源茉莉酸合成，也参与到了其他的调控通路中。上述结果为解析小麦中茉莉酸下游调控通路、花药开裂机制，以及small RNA调控小麦雄性不育和挖掘更多候选small RNA奠定重要基础。