恒温扩增高通量高灵敏度荧光成像检测microRNA的研究

开发简便、高通量、高灵敏度microRNA检测新技术对深入研究microRNA的作用机制和疾病的早期诊断及治疗等具有重要意义。本项目通过在样品microRNA两端连接上通用连接子序列，应用切口酶引导的反转录恒温扩增反应，产生含有microRNA互补序列的cDNA文库；在溶液中加入通用模板，使所有cDNA成环，形成环形锁式探针文库。然后，采用两种方法进行成像分析：一是直接以通用模板作引物，引发恒温滚环扩增反应，产生序列重复的长链DNA，应用多色量子点标记探针进行荧光成像检测，可同时检测多种microRNA；二是转移环形探针到固定了多种microRNA相应捕获探针的微阵列芯片上，进行滚环扩增反应，采用一种通用荧光标记探针进行荧光成像检测，构建microRNA的表达图谱。所建立的两种恒温扩增、荧光成像分析方法可为microRNA的深入功能研究提供简便、高通量、高灵敏度的分析技术平台。

利用恒温滚环扩增（RCA）反应结合阳离子共轭聚合物（CCP）荧光共振能量转移（FRET）检测技术，建立了灵敏、均相检测microRNA (miRNA)的新方法, 方法可为miRNA的均相RCA检测和原位成像分析以及临床诊断提供一种新策略。结合RCA和特异连接酶链式反应（LCR）反应双扩增，应用普通荧光染料检测，实现了单核苷酸多态性（SNP）的高灵敏度和特异性分析，方法结合RCA和LCR两种扩增技术的优点，扩展了RCA和LCR的应用，为核酸高灵敏度检测和分子诊断分析提供了新技术。. 基于LCR高效扩增能力和CCP的独特的光捕获特性及信号放大作用，系统研究了均相LCR结合CCP生物传感检测核酸及miRNA的新方法。发展建立了均相LCR结合核酸外切酶I和外切酶III辅助CCP荧光共振能量转移高灵敏度检测SNP的新方法，方法成本低且不需要昂贵的仪器，扩大了LCR的应用，为均相检测LCR以及遗传分析和分子诊断提供了平台。建立了均相LCR结合lambda核酸外切酶辅助CCP生物传感高灵敏度检测miRNA的新方法, 方法可检测低至0.1fM的miRNA分子，应用于人肺组织全RNA样品中let-7a的检测，结果满意。方法进一步简化了均相LCR探针设计，拓展了LCR方法的应用。. 利用双链特异核酸酶（DSN），结合分子信标探针，研究发展了恒温扩增，简便、均相高灵敏度检测miRNA的新方法，方法灵敏度高，特异性好，对于多重miRNA成像分析具有重要意义。应用电化学氧化法新制备了一种水溶性和生物兼容性好的碳纳米粒子（CNP），利用其优良的荧光猝灭能力和表面对单链DNA和双链DNA/miRNA杂交体的亲和力不同，发展建立了一种恒温检测miRNA的新方法。同时，利用核酸酶对单链DNA和双链DNA/miRNA杂合体有不同的降解产物，碳纳米粒子对产物吸附性能存在显著差异的特点，实现了核糖核酸酶 H（RNase H）和脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)的酶活性的检测。方法简便快速，费用低，灵敏度高。