高灵敏度恒温扩增检测端粒酶活性及端粒酶抑制剂的筛选

Telomerase is a ribonucloprotein with reverse transcriptase activity, which can elongate the telomeric sequences of chromosomes with its own RNA as a template. Telomerase is activated in the tumour cells，which is associated with the replicate of telomeres and immortalization of tumour and cancer cells. Detection of telomerase activity may be implemented for the early diagnosis of cancer，and the research of telomerase activity inhibitors is of great significance to the development of anti-tumour drugs. Isothermal exponential amplification reaction(IEXPAR) is a new, rapid and isothermal amplification method. Its amplification efficiency can be equivalent to that of PCR. In our project，we amplify the telomerase elongated product-specific DNA probes with IEXPAR and carry out real-time quantitative detection of amplification products using SYBR Green I as fluorescence dye. We are hoping to use simple and quick method to achieve the high- sensitivity detection of telomerase activity. The extension of telomerase is seperated from IEXPAR through the magnetic separation, which should efficiently eliminate the influence of telomerase inhibitor on subsequent reaction and detection and therefore improve the reliablility of telomerase inhibitor screening.

端粒酶是一种具有反转录活性的核糖核蛋白酶，它可以以自身的RNA为模板，使染色体DNA的端粒不断复制。一般在肿瘤细胞中端粒酶活性被激活，它与染色体DNA端粒的不断复制及肿瘤的不断增值密切相关。所以检测端粒酶活性可能实现对肿瘤、癌症的早期诊断；同时研究端粒酶活性抑制剂对抗肿瘤药物的开发具有非常重要的意义。恒温指数扩增反应（IEXPAR）是一种新型的、快速的、恒温扩增方法，其扩增效率可与PCR相媲美。本项目研究拟通过对端粒酶延伸产物特异性的DNA探针进行恒温指数放大，利用SYBR Green I为染料对扩增产物进行实时定量荧光检测。以期利用简单快速的操作，实现端粒酶活性的高灵敏度检测。同时，利用简单的磁分离技术将端粒酶的延伸反应与DNA探针的扩增反应分开，有效的避免了端粒酶抑制剂对后续扩增反应及检测的影响，从而提高了端粒酶抑制剂筛选的可靠性。

肿瘤细胞的强大活力与端粒酶密切相关。检测端粒酶活性，可以实现对肿瘤、癌症的早期诊断。同时以端粒酶为靶标分子，研究有效的端粒酶抑制剂，对开发抗肿瘤药物具有重要意义。所以，如何快速、有效的检测端粒酶活性成为人们研究的重点。根据研究工作计划，我们研究解决了端粒酶延伸产物特异性的DNA探针的分离，以及该探针引发恒温指数扩增反应（IEXPAR）体系设计的关键问题。结合端粒酶延伸产物的磁性分离，对该产物特异性的DNA探针进行IEXPAR扩增反应，建立了高灵敏度检测端粒酶活性的分析方法。该方法可检测低至4个Hela细胞中的端粒酶的活性，可与基于PCR扩增的端粒重复序列放大技术（TRAP）相媲美。同时，磁性分离可消除组织、细胞提取物对DNA聚合酶活性的影响，提供可靠的分析结果。研究中发现，磁球的使用需要反复的洗涤，增加了操作的繁琐程度，同时导致测定精密度不够理想。之后，我们对实验方法进行了改进，利用磁性石墨烯的吸附功能有效避免了磁球反复洗涤的繁琐操作，增加了方法的检测精密度。在完成计划研究内容之后，我们研究了不同的恒温扩增技术，如环介导等温扩增（LAMP），杂交链式反应（HCR）在端粒酶活性检测中的应用，建立了一系列基于恒温扩增技术的端粒酶活性检测方法。为恒温扩增技术在端粒酶活性检测以及生化分析中的应用开辟了新的途径。对端粒酶活性检测以及已端粒酶为靶标分子的抗癌药物的筛选具有重要意义。