miR-491通过调控T细胞的增殖和凋亡在诱导T细胞衰竭中的作用机制研究

T cell exhaustion is a state of T cell dysfunction that arises during chronic infections and cancer, the exact mechanism is not clear. MicroRNAs are small non-coding RNAs, which can negatively regulate gene expression. There are increasing evidences that microRNAs can regulate the function of T cells including proliferation, apoptosis, and differentiation. Whether microRNAs are involved in the regulation of T cell exhaustion? In our previous study, we found miR-491 was significantly up-regulated in exhausted T cells, and overexpression of miR-491 can inhibit the proliferation and induce apoptosis of T cells. Above data suggest miR-491 may play potential role in the induction of T cell exhaustion. In current project, we plan to study the role of miR-491 on the proliferation, apoptosis and exhaustion phenotype in vitro and in vivo by using retrovirus expression system and antagomiR which can overexpress or inhibit miR-491 level. Then we want to identify the target gene and transcription factor of miR-491 by using luciferase report system, siRNA, western-blot, and Chip. In conclusion, our hypothesis is that miR-491 is up-regulated in exhausted T cells, and miR-491 may inhibit the proliferation and induce the apoptosis of T cells by down-regulating the target genes of Bcl-w, TCF-7, and CDK-4, it will result in the induction of T cell exhaustion. The pathway of TGF-β-SMAD may induce the expression of miR-491 in T cells.

T细胞衰竭是指T细胞在特定情况下出现的功能抑制或失衡，其发生机制仍不清楚。研究证实，miRNAs可参与调控T细胞的增殖、凋亡和分化，那么miRNAs是否也能调控T细胞衰竭？我们在前期研究证实，miR-491在衰竭T细胞中表达上调，过表达miR-491能抑制T细胞增殖，促进T细胞凋亡，且miR-491启动子序列中可能含有SMAD结合位点，提示miR-491可能参与诱导T细胞衰竭。本项目拟利用逆转录病毒和AntagomiR系统，体内和体外过表达及抑制miR-491，研究其对T细胞增殖、凋亡以及衰竭表型的影响，同时通过荧光素酶、siRNA、CHIP等鉴定miR-491的靶基因和上游表达调控因子，以验证假说：miR-491可能通过下调靶基因（如Bcl-w、TCF7和CDK4）的表达，抑制T细胞增殖，促进T细胞凋亡，从而诱导T细胞衰竭，而miR-491的高表达可能受TGF-β-SMAD通路的调控。

T细胞介导的免疫反应对于抗肿瘤免疫至关重要，然而肿瘤微环境中的T细胞功能往往出现抑制或失衡，即T细胞衰竭，其发生机制仍不清楚。研究证实，miRNAs可参与调控T细胞的增殖、凋亡和分化，那么miRNAs是否也能调控T细胞衰竭？本项目按照计划任务书执行，筛选出miR-491在肿瘤模型CD8+T中的表达显著上调，进而深入研究miR-491对T细胞增殖、凋亡以及效应功能的影响，同时鉴定miR-491在CD8+T中的靶基因，并初步探索miR-491在肿瘤模型CD8+T中高表达的调控机制。本项目进展顺利，取得的主要结果如下：1）我们构建了小鼠的结直肠癌肿瘤模型，筛选鉴定出miR-491在结直肠癌CD8+T细胞中表达显著上升；2）成功构建miR-491逆转录病毒，证实体外过表达miR-491后，能够抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖，促进T细胞的凋亡。此外，miR-491过表达后还能减少CD8+T分泌IFN-γ，从而减弱其效应功能；3）鉴定出miR-491在CD8+T细胞中的靶基因为CDK4 （cyclin-dependent kinase 4）、TCF-1 （transcription factor T cell factor 1） 和Bcl-xL （B-cell lymphoma 2-like 1 ）；4）证实肿瘤来源的TGF-β能够诱导CD8+T细胞中miR-491的高表达；5）提出并证实科学假说：miR-491可能通过下调靶基因（如Bcl-xL、TCF-1和CDK4）的表达，抑制T细胞增殖，促进T细胞凋亡。miR-491是T细胞，尤其是CD8+T细胞功能的负性调控因子，有可能参与诱导肿瘤微环境中T细胞的衰竭。miR-491的高表达受TGF-β通路的调控。因此，miR-491可能成为肿瘤免疫治疗的新靶点；6）初步探索miR-491及其他参与调控细胞增殖和凋亡的miRNAs（如：miR-141、miR-30b等）在肿瘤中的作用。本项目按计划进行，进展顺利，已发表SCI论著2篇，投稿SCI论著1篇，发表统计源期刊综述1篇。共培养研究生2名。