肝癌中UCH37对JAB1与p27Kip1的调控作用与相关分子机制

Deubiquitinase plays an important role in the regulation of protein degradation. Our previous studies have shown that express level of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37 (UCH37) is relatively higher in hepatocellular carcinoma than those in normal liver tissue. The interaction between UCH37 and c-Jun activation domain-binding protein 1 (JAB1) was also confirmed. UCH37 may mediate the protein level of JAB1 through deubiquitination. Based on our experimental results and previous reports in the literature, we hypothesized that overexpression of UCH37 could induce deubiquitination of the substrate protein JAB1 and increases its accumulation through their interaction. JAB1 then interacts with a downstream molecule p27Kip1 to form a nuclear complex and accelerates p27Kip1 degradation by ubiquitin-proteasome system to give rise to cell cycle disorders and abnormal cell proliferation, thus resulting to the development of liver cancer. This project will detect the levels of UCH37, JAB1 and p27Kip1 in HCC,assess their clinical significance, validate the role of UCH37 and JAB1 in development of HCC and further clarify their interactions of UCH37, JAB1 and p27Kip1 and the molecular mechanism of UCH37-induced JAB1 deubiquitination and degradation of p27Kip1 in tumorigenesis of HCC to provide a theoretical basis for liver cancer diagnosis and treatment.

去泛素化酶对于蛋白质的降解起重要的调控作用。我们前期研究表明泛素羧基末端水解酶37(UCH37)在人肝癌中过量表达，并且证实UCH37 与Jun激活区域-连接蛋白1(JAB1)存在相互作用，UCH37可能通过脱泛素化途径调控JAB1的蛋白含量。根据以往实验基础和相关文献报道，本项目拟通过病例标本检测与临床资料分析，探讨UCH37、JAB1和p27Kip1在人肝癌中的表达及其临床意义；利用体内和体外实验，验证UCH37和JAB1在肝癌发生中的重要作用；明确UCH37、JAB1和p27Kip1三者之间的相互作用，阐明UCH37通过与底物蛋白JAB1相互作用，导致JAB1去泛素化程度增加而聚积，JAB1与下游分子p27Kip1相互作用形成复合物出核，通过泛素-蛋白酶体系统加速p27Kip1降解，使细胞周期失调而异常增殖，从而导致肝癌发生发展的分子机制，为肝癌的诊断和治疗提供理论依据与实践基础。

肝癌位居我国癌症死亡率的第三位，提高肝癌治疗效果和生存率的关键是早期诊断和特异性治疗，对于肝癌发病机制和关键因子的探索，始终是国内外同行研究的热点。前期研究中，我们分离鉴定了254个差异表达的蛋白质，发现差异蛋白-泛素羧基末端水解酶37。本项目中，我们首先通过在全基因组表达谱、蛋白组学和表观遗传学方面，联合应用生物信息学分析方法，系统的探讨了原发性肝癌患者中UCH37、JAB1和p27Kip1在人肝癌患者血清、癌组织样本和对应癌旁组织中的mRNA表达、蛋白含量、以及相关的miRNA分子和甲基化调控区域的差异，并深入探讨了UCH37、JAB1和p27Kip1在肝癌发生发展中的临床意义；证实了UCH37、JAB1在肝癌样本中的过表达和p27Kip1的表达下调；我们推测UCH37、JAB1对肝癌的发生、发展具有促进作用。.同时在以往小样本的基础上，我们进一步扩大样本量，利用实时定量PCR、Western Blot以及肝癌样本组织芯片的免疫组化实验，验证了UCH37、JAB1和p27Kip1在肝癌组织与对应的癌旁组织中的表达水平与相关性，证实了UCH37、JAB1和p27Kip1与肝癌发生、临床分期、转移复发和预后等的关系。. 体外实验中，为了探讨UCH37和JAB1在肝癌发生、发展中的作用和相关分子机制，我们分别构建了UCH37和JAB1的慢病毒过表达和RNA干扰质粒，并分别筛选获得了UCH37和JAB1的稳定过表达和RNA干扰的肝癌细胞系，进行了UCH37和JAB1的细胞生物学功能实验，并探讨了UCH37和JAB1对下游相关底物分子的mRNA转录水平和蛋白含量的调控；同时我们利用了UCH37和19S蛋白酶体相关分子RPN13、USP14的小分子抑制剂，在肝癌细胞中进行了相关实验，证实了抑制剂RA190，IU-1，bAP-15对细胞活力、增殖、凋亡等细胞生物学功能和相关相关蛋白的调控。. 体内实验中，我们构建了CMV-Cre诱导全身条件性启动的pCMV-loxp-RFP- stop-loxp-UCHL5质粒，获得了全身条件性启动UCHL5+/-小鼠，并通过与Kras持续激活的全身条件性启动KrasG12D+/-小鼠杂交，目前已经获得了UCHL5+/-、KrasG12D+/- 以及UCHL5+/-;KrasG12D+/-双转基因小鼠；同时我们已经获得肝特异表达Cre酶的