Nucleostemin与p27kip1相互作用在肝细胞肝癌发生发展中的作用及机制

p27kip1 is an important tumor suppressor that plays a pivotal role in the pathogenesis of Hepatocellular carcinoma (HCC). p27 primarily binds to and inhibits the activity of CDK2-Cyclin E complex to prevent premature G1/S-phase transition during cell cycle control. Our preliminary data indicated that p27 was mainly confined to the nucleolus in HCC cells. In addition, we identified that p27 interacted with nucleolar protein Nucleostemin (NS) in HCC tissues. On the basis of these findings, we propose the hypothesis that NS protein may induce nucleolar sequestration of p27 through direct NS-p27 association, leading to the hyperactivation of CDK2 and resultant cell cycle progression. To validate the hypothesis, we aim to first investigate the correlation between NS and p27 expression and distribution in HCC specimens, and then clarify the regulatory mechanism underlying NS-p27 through NS overexpression and knockdown in HCC cell lines. Moreover, we will analyze the impact of NS expression on CDK2 activity and cell cycle alteration in HCC cells. Finally, we will study the facilitating role of NS-mediated p27 inactivation on HCC development using nude mice. Our study may help gain an insightful view into the mechanism underlying aberrant cell cycle progression during hepatocarcinogenesis, and thus benefit the development of molecular-targeted therapies in HCC.

p27kip1是肝细胞肝癌（HCC）发生过程中重要的抑癌蛋白，其主要通过结合并抑制CDK2-Cyclin E复合物防止细胞的过度增殖。课题组前期通过预实验发现肝癌组织和细胞中p27结合核仁蛋白Nucleostemin（NS），并且NS可促使HCC细胞中p27发生核仁转位。基于此，课题组提出科研假说：在HCC中，NS通过结合p27并将其禁闭于核仁中，导致p27不能结合并抑制CDK2，从而促进CDK2的过度活化和细胞周期进程。本课题拟①首先在HCC组织中阐明NS和p27的表达和定位关系；②进而在细胞水平分析干预NS的表达对p27表达和定位的影响；③分析干预NS表达对CDK2活性、下游分子通路及细胞周期的影响；④最后在裸鼠模型中分析NS对p27的调控对HCC发生发展的调节作用。本课题的开展有助于阐明肝癌发生中细胞周期紊乱的机制，并为肝癌的靶向治疗提供新的理论依据。

P27是重要的抑癌基因，主要作为CDK2-Cyclin E复合物抑制蛋白发挥细胞周期阻滞作用。P27的表达下调和肝癌的恶性进程及不良预后存在密切的联系，但目前关于p27在肝癌组织中表达下调和功能失活的机制尚不清楚。本课题前期预实验发现一个新型的干细胞标志物Nucleostemin（NS）可以直接结合p27并调节后者的活性。因此，本课题主要的目的是阐明NS对p27的潜在调控机制。.课题组主要在蛋白相互作用、分子机制、细胞行为、动物实验和临床组织表达分析等方面研究NS与p27的相互作用机制及NS对p27的调控作用。首先，课题组利用免疫沉淀、GST pull down和细胞免疫荧光实验等明确了NS和p27存在相互作用并阐明了两者的相互作用区域及两者在肝癌细胞中的定位。之后，课题组发现p27在核仁中的泛素化水平显著高于核质中的部分，因此提出NS可能通过募集p27至核仁并促进p27在核仁中的多聚泛素化，通过一系列实验课题组证明了上述假说并发现核仁是p27在肝癌细胞中的主要泛素化场所。之后，课题组证明了NS通过调控p27的表达对肝癌细胞的增殖、细胞周期、体外克隆形成和体内成瘤均有显著的促进作用。最后，课题组在临床病例层面阐明了NS和p27在肝癌组织中表达程明显的负相关性，并发现两者的表达均和肿瘤分化及AFP水平存在显著相关性，且NS和p27均具有预测肝癌患者预后的价值，两者结合分析可以非常显著预测患者的预后。.基于上述研究结果，课题组在多个层面上阐明了NS对p27的调控机制以及上述机制对肝癌进程的影响。因此，本课题阐明了p27调控的一个新的机制，并提示NS是一个非常有前景的肝癌治疗靶点，为肝癌的诊断和治疗提供了新的理论依据，具有重要的科学价值和临床意义。相关成果发表在著名肿瘤学期刊Cancer letters杂志上，并获得发明专利一项！