核基质附着区调控哺乳动物细胞表达系统转基因表达的特性及其机制

Matrix attachment regions (MARs) are DNA sequences that can bind to nuclear matrices specifically, which can decrease transgenic silencing and increase transgene expression level. Our previous studies have demonstrated that MARs can improve transgene expression level in Chinese hamster ovary (CHO) cells, the highest transgene expression level can be increased to 46 times compared with the control. In addition, the regulatory effects confer the characters of "position effect", "superimposition effect", etc(Gene,2012). However, the compatibility of MAR improving transgenic expression is bad,and the mechanism has been unclear. This project is to further explore these issues. The contents mainly include: the key regulatory elements will be determined through gradually cloning and function verification. These findings will provide the theoretical and experimental basis for establishing the stable efficient mammalian cell expression system and explaining the MAR regulatory mechanism.

核基质附着区(matrix attachment regions，MARs)是与核基质特异结合的DNA序列，能够减少转基因沉默，提高转基因表达水平。申请者前期研究证实MARs能提高中国仓鼠卵巢(CHO)细胞转基因表达，最高可以提高46倍，且调控作用具有"位置效应"、"叠加效应"等(Gene,2012)。但MAR提高转基因表达的适配性欠佳，机制尚不清楚。因此本项目拟对此做进一步的探索。主要包括：采用渐次克隆、功能验证等分析MAR调控基因表达的关键元件及规律;为建立稳定高效哺乳动物细胞表达系统及阐明其调控机制提供理论和实验基础。

核基质附着区(matrix attachment regions，MARs)是与核基质特异结合的DNA序列，能够减少转基因沉默，提高转基因表达水平。申请者前期研究证实MARs能提高中国仓鼠卵巢(CHO)细胞转基因表达，且调控作用具有"位置效应"、"叠加效应"等。但MAR提高转基因表达的适配性欠佳，机制尚不清楚。因此本项目做了进一步的探索。根据β-珠蛋白MAR序列，结合前期研究及生物信息学分析，设计PCR引物，分别从5′和3′端分段渐次克隆MAR片段，片段之间重叠100-150bp。β-珠蛋白MAR共分6段进行PCR克隆，测序。将克隆的β-珠蛋白MAR分片段用Kpn I及Bgl II酶切，连接载体，构建pCAM1~ pCAM6分别包括6个渐次片段MAR片段的表达载体，酶切测序鉴定。将上述6个载体及包括β-珠蛋白MAR全长的表达载体pCAMF及pCAG对照载体转化CHO细胞，G418筛选获得稳定表达细胞株，ELISA分析细胞CAT酶含量，生物信息学分析能提高转基因表达的序列特征。结果表明所克隆的MAR片段序列完全正确，成功构建了表达载体；含MAR渐次片段的表达载体pCAM2、pCAM3、pCAM4、pCAM6转化的CHO细胞CAT酶含量比不含MAR的载体pCAG转化的细胞有显著的提高。统计学分析显示，β-珠蛋白MAR全长可使CAT报告基因表达水平提高8.1倍，pCAM3、pCAM4、pCAM6分别可提高CAT基因表达水平4.83倍、3.40倍、1.89倍。pCAM1不能提高CAT表达量、pCAM5提高CAT基因表达量不显著，其余几个MAR分段片段都可以提高CAT基因表达量。作用次序依次为：pCAM3 > pCAM4 > pCAM2 > pCAM6 > pCAM5 > pCAM1，但都小于全长MAR序列对CAT基因的作用。并且MAR可降低不同CHO细胞转化株CAT表达水平的差异。生物信息学分析表明：M1，M5 无MAT特征性基序保守序列，M2含有一个MAR- like motif；MAR3含有1个MAR-like motif、2个Topo位点；MAR4含有1个MAR-like motif、1个Topo位点；MAR6含有1个Alu保守序列。从结果可以得出MAR-like motif及Topo基序能促进转基因表达水平提高，其次Alu序列也有助于转基因提高。