基于MAR的新型CHO细胞表达系统优化及机制

It is very important to establish the highly efficient and stable expression system for recombinant pharmaceutical protein production. In our previous studies, we have established a new type of CHO cell expression system using matrix attachment regions(MARs). However, this system needs to be further optimized, and the molecular mechanism is still unclear. In this project,we will optimize the molecular assembly of MAR-containing expression vectors with other regulator elements, such as promoter, intron, IRES etc, to screen the efficient and stable expression vectors in CHO cells.We will target the MAR-containing expression vetors in the specific sites of CHO cells using CRIPSR/Cas9 and homologous recombination technology, to construct a site-specific integration CHO expression system mediated by MARs.Furthermore, we will analyze the transgene copy number, histone acetylation, phosphorylation status, MAR recruiting transcription factors and chromatin conformation change. These findings will verify our proposed hypothesis: MARs can recruit the histone acetyltransferase and other remolding proteins,which inhibit heterochromatin spreading and then modify the chromatin state, resulting in promoting the expression level of transgenes.This project will establish a new type of highly efficient and stable expression system with our independent patents, and provide the basis for the molecular assembly of expression vector and understanding MARs’ regulation mechanism.

建立高效稳定的表达系统对于药物重组蛋白的生产至关重要。申请者前期利用核基质附着区（matrix attachment region, MAR）建立了一种新型的CHO细胞表达系统，但此表达系统需要进一步优化，机制尚不清楚。本项目将进一步优化MAR与载体上其他调控元件（如启动子、内含子、IRES等）的分子组装，筛选高效稳定表达载体；利用CRIPSR/Cas 9及同源重组技术定点整合MAR表达载体，构建MAR介导的定点整合CHO表达系统。同时分析转基因拷贝数、组蛋白的乙酰化、磷酸化状态、MAR招募转录因子及染色质构象变化，以验证我们提出的MAR调控机制的染色质重塑假说：MAR能够招募组蛋白乙酰转移酶HAT及其他重塑蛋白以抑制异染色质传播，进而修饰染色质的状态并促进转基因表达。本项目的实现将建立新型的拥有自主知识产权的高效CHO细胞表达系统，理论上为载体的分子组装及阐明MAR调控机制奠定基础。

近70%的重组蛋白药物是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产的。国内动物细胞培养水平低，表达水平较低、更缺乏具有独立自主知识产权的CHO细胞表达系统，这一现状极大地制约了我国重组蛋白药物产业化的发展。因此，建立国际领先的用于重组蛋白生产的CHO细胞表达系统具有重大科技创新意义。本项目以CHO细胞表达系统为研究对象，系统优化了CHO细胞表达载体，从核基质结合区（MAR）序列、启动子、内含子、遍在染色质开放表达元件(UCOE)、抗阻遏元件（SATR）、筛选标记等调控元件全面进行了优化，筛选出了能显著提高CHO细胞重组蛋白表达的表达载体。通过测试，单抗的cell pool表达水平高达3.0g/L以上，单细胞克隆表达水平在10g/L以上。重组蛋白如促红细胞生成素EPO、人肝细胞生长因子表达水平分别在100mg/L以上，抗体及蛋白的表达水平均显著高于目前文献报道的表达水平。比优化之前的表达载体表达水平能提供5~7倍。此外，利用CRISPR/Cas9技术构建了MAR表达载体定点整合CHO表达系统，并进行了MAR调控机制的研究。.本项目按照项目计划书拟定的研究目标和计划，通过四年的研究成功构建高效的CHO细胞表达系统，已经超过完成预期的目标。本课题发表论文16篇，其中SCI收录论文13篇，已授权发明专利7项，申请国际发明专利2项，培养学术骨干3名，其中1名由副教授晋升教授，1名晋升副教授，培养研究生9名。获得河南省科技进步二等奖1项、实现技术转移3项，出版学术专著1部。