微环-附着体表达载体系统的适配性及其机制

Expression vector play a key role in gene therapy, but the current vectors used have some limitaion. In our previous studies, we established one new kind of expression vector: minicircle episomal vector, which could eliminate the bacterial elements and episomal exist, not integrate into the chromosome of Chinese hamster ovary (CHO) cells. The vector could overcome the side effect of the traditional expression vector,which caused by the bacterial elements and integration effect. The patent of this vector has been authorized. However, the compatibility and mechanism of the vector has been unclear. This project will study the compatibility and mechanism of the key regulator elements and host cell expression system. The present study will use the molecular technology to clone different promoters and study the compatibility between promoters and vector,to explore the universal effective promoter. Different target cells will be utilizied to explore their compatibility. Transgenic copy numbers and integration sites will further be analyzed. Finally, we will focus on the stress-induced duplex destabilisation and chromatin conformation of stably transgenic cells mediated by MAR. This study will provide theoretical and experimental basis for establishing the new gene therapy vector.

表达载体在基因治疗中起着关键的作用，基因治疗目前采用的载体都存在一定的缺陷。微环-附着体表达载体（mincircle episiome vector）是申请者前期构建的一种新型的哺乳动物细胞表达载体，可以消除原核元件、附着而非整合到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)染色体上，克服传统载体的原核元件及整合效应带来的副作用，安全、高效、稳定地驱动转基因表达，已获得国家授权发明专利。载体的适配性及其机制尚待进一步研究。本项目拟对微环-附着体表达载体的关键调控元件、宿主细胞的适配性及其机制进行研究。拟采用分子生物学技术分别克隆不同的启动子，分析载体与不同启动子的适配性，探讨载体适配的通用高效的启动子；进而探讨载体与宿主细胞的适配性。分析转基因拷贝数和整合位点、应力诱导的双重不稳定性及细胞转化株的染色质构象变化，为建立新型的基因治疗载体提供理论和实验基础。

表达载体在基因治疗中起着关键的作用，微环-附着体载体可以消除原核元件、附着而非整合到染色体上，克服传统载体的原核元件及整合效应带来的副作用，安全、高效、稳定地驱动转基因表达，但载体的适配性及其机制尚待进一步研究。本研究对微环-附着体表达载体的启动子和宿主细胞的适配性及其机制进行了研究。将不同启动子（EF1α、CAG、PGK、SV40、RSV、UBC、β-globin启动子）克隆至微环-附着体载体上，构建含不同启动子的载体，将构建好的表达载体转染CHO细胞并筛选稳定细胞株，通过流式细胞术检测eGFP的表达，质粒还原实验和荧光原位杂交检测质粒的附着状态及拷贝数，观察不同启动子对转基因表达的水平及长期稳定性影响。转染后48h的eGFP阳性率和瞬时表达显示，含EF-1α启动子的载体转染阳性率和eGFP 的表达水平最高，其次为CAG、CMV、RSV，而PGK、β-globin和UBC启动子驱动微环-附着体载体的活性较低。稳定转染的CHO细胞在有或无G418筛选压力下稳定长期培养，转染后78天流式检测EF-1α启动子驱动下的eGFP表达水平最高，而UBC、PGK和β-globin启动子的转基因表达在转染后78天eGFP几乎无表达。且质粒还原实验和荧光原位杂交实验证明转染质粒在哺乳动物细胞中以附着于染色体外的形式存在，不同的启动子驱动转基因的水平不同，其作用机制可能与启动子中所含的转录因子调控元件的种类和数量有关。将附着体载体转染不同的宿主细胞（包括BJ 、HSF、Chang liver、A2780、A-375、A-431、A498 、A549 、CaEs-17、Eca-109 、SC5-7和HMy2.CIR，共12种），流式细胞术检测转染阳性率和eGFP的表达，质粒还原实验和荧光原位杂交检测质粒的附着状态。结果发现，在A375、Eca-109和 Chang-liver 细胞中，转染效率和转基因表达较高，长期培养稳定性较好，而在BJ、HSF和 A431 细胞中出现转基因沉默，且质粒在A375、Eca-109和 Chang-liver细胞中以低拷贝附着存在。这些实验结果为提高微环-附着体载体的转基因表达、长期稳定性和质粒拷贝数提供了有用的信息。