低温胁迫下番茄叶绿体whirly蛋白的功能分析

Low temperature stress is a major factor that limits the agricultural productivity of chilling-sensitive crops in protection cultivation, such as tomato and cucumber in the north of China. As one kind of transcription factors in plant cell, whirly proteins are ideal candidates for crosstalk bewteen chloroplast and nucleus and function in response to low temperature. In this research, we are planning to clone chloroplastic whirly protein gene (LeWhy1) from tomato and to obtain sense and antisense transgenic tomato plants. A recombinant of prokaryotic expression vector will be constructed to obtain antiserum of whirly protein. Northern and western blot will be used to reveal RNA and protein signals corresponding to LeWhy1 in transgenic plants. Under chilling stress, BN-PAGE will be used to mensurate stability of photosynthetic protein complex. Turnover of D1 protein, gas exchange parameters, chlorophyll fluorescence, the activities of antioxidantive enzymes and levels of ROS will be mensurated to investigate the photoprotection function of LeWhy1. Yeast one-hybrid and two-hybrid systems will be used to screen the target gene and the interaction proteins of LeWhy1, respectively. Photoprotection mechanism and role of LeWhy1 protein as a signal between plastid and nucleus will be analyzed. These researches are important for the cultivation and breeding of chilling-sensitive vegetable plants for chilling tolerance.

低温胁迫是我国北方地区番茄、黄瓜等喜温蔬菜作物保护地生产中的主要障碍因素之一。Whirly蛋白是植物细胞内的一种转录因子，是细胞核和叶绿体交叉对话的理想载体，对于植物的低温响应具有重要作用。克隆番茄叶绿体whirly蛋白基因（LeWhy1），获得含LeWhy1正义、反义基因的转基因番茄植株；构建原核表达载体，体外表达whirly蛋白，制备抗体；Northern和Western 杂交检测转基因植株；BN-PAGE技术检测低温胁迫下光合相关蛋白复合体的稳定性，分析PSII反应中心D1蛋白周转，测定对照植株和转基因植株光合气体交换参数、叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性、活性氧水平等；酵母单杂交分析LeWhy1蛋白与所调控基因的互作，酵母双杂交寻找LeWhy1互作蛋白。探讨低温胁迫下番茄叶绿体leWh1y蛋白的光保护机制及其在质体信号通路中的作用。该研究对于指导喜温蔬菜栽培和抗逆育种具有重要意义。

研究了番茄Whirly1基因的功能。①分析了该基因的表达特征，低温和氧化胁迫诱导该基因的表达，构建了SlWHY1的亚细胞定位载体，发现SlWHY1蛋白可以定位在叶绿体和细胞核。构建了SlWHY1的Flag、Crispr-Case9和RNAi载体，获得了过表达SlWHY1的转基因番茄以及杂合突变体植株。②构建了原核表达载体，制备SlWHY1的抗体，western blot鉴定了各转基因株系中SlWHY1的蛋白表达水平，并分析了过表达株系与野生型在低温胁迫条件下的生长表型、叶绿体超微结构、细胞膜受伤害程度以及O2-•和H2O2含量。与比野生型相比，过表达株系生长状态更好，体现在过表达株系具有更稳定的膜结构、较低水平的活性氧积累、更低水平的叶绿体淀粉积累及更稳定的光合机构。③RNA-seq数据分析、相关生理指标的测定及BN-PAGE实验的结果同样表明过表达植株与野生型相比具有更稳定更高效的光合机构，其中以PSII反应中心最为明显。Western blot实验和qRT-PCR分析结果进一步表明，低温处理后过表达株系的D1蛋白含量要高于野生型植株，但经D1蛋白合成抑制剂硫酸链霉素（SM）处理后过表达株系中D1蛋白的含量与未处理的野生型相差无几，说明SlWHY1对于PSII的保护作用可能依赖于D1蛋白的从头合成。分析了编码D1蛋白的PsbA基因的启动子与SlWHY1蛋白之间的关系，结果表明在低温胁迫下叶绿体SlWHY1蛋白能够结合到PsbA的启动子上并激活其转录，从而维持D1蛋白的水平。另一方面，在细胞核中，发现SlWHY1能够调控PsbW基因及AMY基因的表达。因此，我们认为SlWHY1通过维持PSII结构的稳定性和加速光合产物的分解及转运两方面来保护低温胁迫下的光合机构，从而提高番茄植株对低温胁迫的耐受程度。④此外，我们还克隆了番茄线粒体SlWHY2基因，并分析了干旱条件下SlWHY2基因的功能。研究结果对于指导蔬菜在低温胁迫下丰产栽培与研究低温胁迫下的光合能量产物代谢具有重要的意义。