精子介导转基因过程中外源基因整合机制的研究

Sperm-mediated gene transfer (SMGT) is one of the important techniques for generating transgenic animals. However, the underlying molecular mechanisms remain undefined. It has been demonstrated that exogenous genes was transferred via a protein named DNA binding protein（DBP）into sperm genome. Our previous data by using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis, mass-spectrometric and bioinformatics preliminarily showed that the protein which response for gene transfer should be IAM38. To further investigate the molecular mechanisms of SMGT, firstly, we will identify and verify the DNA binding protein by Two-Dimensional Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and blocking antibody. Moreover, the transport route for the compound exogenous DNA and protein will also be explored. Secondly, to uncover the mechanisms of exogenous DNA integration, the plasmid vector harboring a enhanced green fluorescent protein (EGFP) will be interrupted by an intron. Finally, the integration sites will be analyzed by genome walking and the specificity will be explored via blasting searches against the published genomic database.The object of the study was to clarify the molecular mechanisms of exogenous genes into the host genome, which will lay the theoretical foundation for the development of transgenic research.

精子介导转基因是目前主要的生产转基因动物方法之一，但其分子机制目前尚未明确。文献报道显示外源基因由蛋白质介导转运进入精子内部，我们前期通过非变性单向聚丙烯酰胺电泳、质谱技术以及生物信息学分析，初步认为精子介导外源基因转运的蛋白质（DNA Binding Protein，DBP）应为IAM38。为了完善精子介导转基因的分子机制，本课题拟进一步通过非变性双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和抗体封闭等对精子结合外源基因的DBP进行鉴定并验证；并对结合了外源基因的蛋白质复合物的转运方式进行深入探讨；在报告基因EGFP片段内部插入内含子，追踪并探讨进入精子核内部的外源基因的整合方式，揭示出外源基因进入宿主基因组的路径；最后，采用Genome Walking方法对转基因进行整合位点的鉴定，分析整合位点的特异性和规律。本课题拟通过上述探讨从而阐明外源基因进入宿主基因组的分子机制，为转基因技术的发展奠定理论基础。

采用非变性PAGE电泳对DNA/精子蛋白质共孵育复合物和精子自由蛋白质进行分离联合质谱技术初步探讨了精子与外源DNA相互结合的分子机制。结果发现，DNA/精子蛋白质共孵育复合物泳道出现一条蛋白质-DNA结合的滞后带，对该条带进行质谱分析获得7个蛋白质，通过理化性质和蛋白保守区域分析发现其中的IAM38蛋白质均符合DBPs的性质，进一步SMART在线对7个蛋白质的功能结构域进行分析，发现仅IAM38具有若干免疫球蛋白IG结合位点及蛋白质与DNA相互作用的结构功能单元（包括锌指结构、亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构）。Western Blotting结果显示免疫球家族蛋白CD4分子在精子中有分布，但在精浆中并不存在；利用CD4分子单克隆抗体对兔精子CD4分子功能位点进行封闭后再与pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒共孵育，原位杂交结果显示：兔精子经CD4分子抗体封闭后与未封闭组相比不影响其与外源DNA的携带能力（68.3% vs 75.7%，P>0.05），但极显著地降低了外源DNA的内化（7.5% vs 51.4%，P <0.01）。将CD4分子单克隆抗体封闭后的精子进行ICSI-MGT，发现封闭后的兔精子ICSI-MGT胚胎的分裂率和囊胚率与未封闭对照组相比虽然无显著差异（70.5% vs 76.7%； 39.7% vs 32.6%；P >0.05），但阳性胚胎率及囊胚阳性率均极显著低于未封闭组（7.8% vs 43.8%；7.1% vs 56.1%，P<0.01）。对与不同浓度质粒孵育后的精子基因组进行琼脂糖凝胶电泳发现，随着外源质粒浓度的升高精子基因组发生降解而使胚胎发育能力受到影响。上述结果表明：精子结合外源DNA模式为首先外源DNA与精子质膜的跨膜蛋白质IAM38结合，然后二者依赖免疫球蛋白的异嗜性与CD4分子形成DNA/IAM38/CD4复合物完成DNA入核转运。