α-酮戊二酸缓解草鱼氨氮胁迫的作用途径和机制研究

Ambient ammonia is an important environmental stress factor in aquaculture systems, which has serious negative effects on feeding, growing, immunity and anti-infection ability of fish, and seriously hindering the healthy development of aquaculture. How to alleviate ambient ammonia stress on fish is one of the mayor issues to be solved in intensive aquaculture. Researches done by others in mammals and the applicant in the grass carp show that α-ketoglutarate (AKG) can significantly alleviate fish's response to stimulation and promote their growth, while the underlying mechanisms remain unclear. Based on the previous achievements of the project group, the author firstly exposes juvenile grass carps to environments with different ammonia concentration, then feeds them with the basal diet or experimental diet added AKG, uses the theory,method and technology combined of aquaculture, nutrition, physiology, biochemistry and molecular biology, contrasts the differences of amino acid metabolism and nitrogen metabolites excretion among different groups, aiming to research acting way of of AKG on alleviating ambient ammonia stress on grass craps. Contrasting the differences in the expression and phosphorylating of key protein in TOR, Glu receptor signal transduction pathway, to reveal the target genes and molecular mechanisms of AKG alleviating ambient ammonia stress. This research has important theoretical significance both in enriching fish physiology content and in developing AKG as new anti-stress reinforcing agent or nutritional regulating agent for grass carp and other aquatic animals.

氨氮是水产养殖系统中重要胁迫因子，对鱼类的生长、免疫和抗感染产生严重负面影响，严重阻碍水产养殖业的健康发展。如何缓解氨氮对鱼类的胁迫是集约化养殖亟待解决的重要问题之一。他人在哺乳类及申请者在草鱼的研究表明，α-酮戊二酸（AKG）能缓解动物应激、促进生长，但作用机制还不清楚。本项目拟在本课题组前期工作基础上，以草鱼为对象，让其暴露于不同氨氮浓度环境中，饲喂基础饲料或添加AKG的饲料；借助养殖学、营养学、生理学、生化和分子生物学等学科相结合的理论、方法和技术，比较不同处理组间鱼的氨基酸代谢、蛋白质周转和氮代谢产物排泄等差异，探讨AKG缓解草鱼氨氮胁迫的作用途径；通过分析TOR、Glu受体信号传导路径关键蛋白的表达和磷酸化水平的差异，探讨AKG缓解胁迫作用的靶基因和分子机制。研究成果对于丰富鱼类生理学内容具有重要的理论意义，可为开发AKG为草鱼及其它水产动物新型抗应激剂或营养调节剂提供理论依据。

我们严格按照本基金的研究计划，开展了本基金的各项研究内容。目前已按计划基本完成了本基金的研究内容。在基金的资助下，我们共发表科研论文4篇，其中SCI论文1篇，申请国家发明专利2项，其中1项已授权。培养硕士研究生3名。已取得的主要结果如下：.本项目研究了在一定条件下，氨氮对草鱼幼鱼的急性毒性效应，结合草鱼幼鱼氨氮的96 h 半致死浓度量化结果（0.47mg/L），全面分析了0.35 mg/L氨氮的急性胁迫对草鱼血氨含量和不同组织中Rhcg2和Rhag mRNA的表达量的影响。结果表明：草鱼氨氮急性胁迫后，血氨含量呈先上升、后下降、再上升的趋势，草鱼能通过提高Rhcg2、Rhag对氨的转运缓解氨氮胁迫的部分损伤。.在上述研究的基础上，我们分别用基础饲料和添加0.75%的AKG饲料饲喂草鱼幼鱼60d，然后对草鱼进行24 h急性氨氮胁迫，结果表明：饲料中添加0.75%的AKG 能促进草鱼生长，提高草鱼机体抗氧化酶活和抗氧化物含量，缓解氨氮急性胁迫导致的氧化应激；通过提高机体谷氨酰胺合成酶活和肝脏谷草转氨酶活，促进氮的代谢产物转化为谷氨酰胺；通过提高鳃组织钠－钾－ATP酶活和总ATP酶活，调控Rhcg2和Rhag mRNA在不同组织中的表达，促进氨氮的排泄，从而缓解氨氮急性胁迫导致的血糖和氨氮升高以及对肝脏的损伤。研究还发现，在急性氨氮胁迫下，AKG能将草鱼的氮代谢产物部分转化为尿酸。.在项目的支持下，我们研究了AKG对慢性氨氮胁迫草鱼的影响，结果表明：在慢性氨氮胁迫下，AKG能减少血浆中尿素的含量，提高血浆中总蛋白的含量，促进氨氮的排泄和转化为非必需氨基酸，从而缓解慢性氨氮胁迫。因TOR信号传导路径关键蛋白的表达和脑组织中NR1、NR2 mRNA丰度变化的实验正在进行中（估计明年6月份前能完成），所以AKG是否通过TOR途径和离子型Glu受体途径来缓解草鱼的氨氮胁迫的分子机制有待确定。.综上所述，研究结果对于丰富鱼类生理学内容和为开发AKG作为草鱼及其它水产动物新型抗应激剂或营养调节剂均有重要意义。