α-酮戊二酸依赖酶的时间分辨晶体学研究

α-Ketoglutaric acid (α-KG) dependent oxygenases, which play important roles in biosynthesis, metabolism and pathogenesis, are one of the largest enzyme families widely existing in the life world. Therefore the enzyme engineering and inhibitor screening targeting to α-KG oxygenases are critical to bio-production and drug design. However, lack of the dynamic information in ordinary structure analysis hampered the related application studies. Time-resolved crystallography is a powerful technique to capture the intermediates in chemical reactions and depict the dynamic conformational changes in nanosecond time scale. However, the starting time point could be accurately determined only in photoactive reactions and few proteins are applicable. This project aims to make conversional enzymatic reaction to be photo-reactive by genetic incorporation of unnatural amino acid and apply this novel technique to α-KG oxygenases. The catalytic reaction process will be recorded by time-resolved crystallography and the mechanism of several typical α-KG oxygenases will be studied by capturing the short-lifetimed reactive intermediates and corresponding conformational changes. This project will not only expand the sample adaptability of protein time-resolved crystallography, but also provide direct evidence for α-KG oxygenase engineering and inhibitor design.

α-酮戊二酸依赖的加氧酶是在生物界广泛存在的最大酶家族之一，在生物合成与代谢、疾病的发生发展等方面具有重要作用。因此，该酶的性质改造和抑制剂筛选分别是生物制造和药物设计的重要内容。然而，由于目前常规的结构分析缺乏动态信息，阻碍了相关应用研究的发展。时间分辨晶体学可以在纳秒尺度捕捉化学反应的瞬时中间体并揭示反应过程的动态结构。但由于只有光激活的反应才能精确确定反应时间零点，所以目前只适用于极少数蛋白。本项目拟利用特有的非天然氨基酸标记技术，将普通生化反应改造为光激活反应，并将此技术应用于α-酮戊二酸依赖的酶家族成员。通过测定时间分辨晶体结构，捕捉底物到产物过程中的瞬时中间体及其相应的酶分子氨基酸修饰和构象变化过程，进一步阐明α-酮戊二酸依赖酶的催化机制。本项目研究不仅能拓展时间生物大分子时间分辨晶体学的样品适应性，也将为α-酮戊二酸依赖酶的工程改造和抑制剂筛选提供更精确的结构证据。

α-酮戊二酸依赖酶和磷酸吡哆醛依赖酶是在生物界广泛存在的酶家族，在生物合成与代谢、 疾病的发生发展等方面具有重要作用。它们的三维结构、底物结合方式以及催化机制是相关药物设计和生物制造的重要基础。酶的动态结构、催化过程中的构象变化和反应中间体是阐明催化机制的重要依据。然而，由于目前常规的结构分析缺乏动态信息，阻碍了相关应用研究的发展。时间分辨晶体学可以在纳秒尺度捕捉化学反应的瞬时中间体并揭示反应过程的动态结构 。但由于只有光激活的反应才能精确确定反应时间零点，所以时间分辨晶体衍射目前只适用于极少数蛋白。本项目1）研究了α-酮戊二酸依赖酶家族的乙烯合成酶和反式脯氨酸羟化酶以及它们与底物/产物的复合物晶体结构，发现了目前活性最高的乙烯合成酶，并提出其N端结构域与其高活性相关。在催化过程中会产生草酸，支持该酶采用草酸中间体的催化机制。反式脯氨酸羟化酶的晶体结构研究揭示了该酶产物手性选择性的结构基础。并通过与顺式脯氨酸羟化酶的结构比较揭示了α-酮戊二酸采用in-line或off-line结合方式的氨基酸序列特征。2）利用特有的非天然氨基酸标记技术，构建了光激活的赖氨酸氨基转移酶和二氧化碳还原酶。为时间分辨晶体衍射提供了新的材料制备方法。3）利用常规X射线收集酶晶体与底物不同混合时间的衍射数据也能捕捉一些反应中间体和酶催化过程中的中间构象。本项目测定了5氨基乙酰丙酸合成酶和反式脯氨酸羟化酶在不同反应时间点的晶体结构，获得了若干不同状态的酶活性中心结构和反应中间体结构，为深入揭示酶催化机制提供了进一步的依据，也为α-酮戊二酸依赖酶和磷酸吡哆醛依赖酶催化反应的普遍规律提供了新的线索。