锌离子调控肠道病毒EV71 2A蛋白酶生物活性的分子机制研究

Zinc is an essential trace element for organisms with catalytic and structural roles involved in a variety of enzymes and protein function, plays a vital role in all kinds of life activities. Zinc ion exists in a variety of organisms, including virus. Enterovirus 2A proteases and hepatitis C virus nonstructural protein 3 (HCV NS3) are typical representative. In these protein structures, zinc ion located between two domains and involved in the hydrolysis process indirectly, at this point, we know very little details about the function and molecular mechanisms of zinc ion in this process. In this project, we will apply fluorescence resonance energy transfer (FRET) to determine the activity of mutated EV71 2A, and obtain the details of overall structure and coordination of zinc ion using Circular dichroism (CD), X-ray Absorption Fine Structure (XAFS) and X-ray crystallography. Finally, we will clarify the important role of zinc ion in the hydrolytic activity and maintenance of the overall structures. These new insights should facilitate the future rational design of efficient 2A protease inhibitors.

锌是生物体的必需微量元素，其通过催化和结构作用参与机体多种酶和蛋白功能，与生命活动密切相关。锌在多种病毒的蛋白酶中广泛存在，如肠道病毒的2A蛋白酶、丙型肝炎病毒的非结构蛋白NS3。在此类蛋白酶中，锌离子位于蛋白质的两个结构域之间，不直接参与底物的水解催化过程，对此类锌离子在蛋白酶发挥水解活性过程中的调控作用及分子机制依然未知。本项目将以引起婴幼儿手足口病的肠道病毒71型的2A蛋白酶（EV71 2A）为研究对象，对蛋白酶中的锌离子进行解离和替换、配位氨基酸进行突变，运用荧光能量共振转移等技术对其水解活性进行测定；结合使用圆二色谱、X射线吸收精细结构谱、蛋白质晶体学等技术手段，分析锌离子解离、替换及配位氨基酸突变后的三维结构与水解活性的变化，从原子和分子水平阐明锌离子在调控蛋白酶水解活性和维持蛋白酶整体结构方面的重要作用。该研究将为此类蛋白酶为靶点的药物开发提供新的思路和见解。

锌是生物体的必需微量元素，其通过催化和结构作用参与机体多种酶和蛋白功能，与生命活动密切相关。锌在多种病毒的蛋白酶中广泛存在，如丙型肝炎病毒的非结构蛋白NS3、肠道病毒的2A蛋白酶。在此类蛋白酶中，锌离子位于蛋白质的两个结构域之间，不直接参与底物的水解催化过程。本项目将以引起婴幼儿手足口病的肠道病毒71型的2A蛋白酶（EV71 2A）为研究对象，将与锌离子配位的C56、C58、C116、H118进行突变，构建了20种与锌离子配位相关的突变体，突变体在表达过程中均无法正确折叠进而以包涵体形式存在；其次，同时制备得到锌离子缺失型Apo-EV71 2A，动态光散射及圆二色谱结果显示，EV71 2A在失去锌离子以后，β折叠含量降低且粒径增加， Apo-EV71 2A结构更加松散且丧失活性；再次，以EV71 2A为靶点开展了药物筛选工作，购置虚拟筛选结果中的10种化合物，并得到一种化合物与EV71 2A（C110A）的复合体晶体结构，但体外抑制活性较低。综上所述，锌离子在维持EV71 2A空间结构及促进EV71 2A正确折叠方面发挥关键作用。..与此同时，本研究组还针对其它金属蛋白开展了结构设计和改造工作，比如人源重链铁储藏蛋白、谷氧还蛋白及中心蛋白，并通过X射线晶体学解析其三维结构