HCV核心蛋白影响microRNA形成在HCV感染致癌中的机理研究

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是严重威胁人类健康的传染性病原体，易导致慢性感染及肝脏肿瘤，但其机制尚不清楚。miRNA是基因表达的一种重要调节方式，在肿瘤形成过程中有重要作用。Dicer（一种RNaseⅢ）是miRNA形成的关键酶。已知HCV核心蛋白能与细胞内RNA解旋酶结合，推测核心蛋白亦可能结合Dicer并影响其功能，从而引起miRNA表达异常，最终导致肝脏肿瘤的形成。我们预实验证实HCV核心蛋白的确可以与Dicer直接结合并影响其活性。本课题拟通过HCV核心蛋白转染胎肝原代细胞，采用miRNA基因芯片技术、实时荧光定量PCR技术检测转化与未转化胎肝原代细胞miRNA表达谱的差异；并利用生物信息学预测技术和分子生物学技术进行差异表达miRNA功能研究，从而寻找出与肝脏肿瘤发生相关的miRNA及其靶基因，为进一步阐明HCV感染的慢性化及致癌机理找到新的切入点。

目的：microRNA-152（miR-152）在HBV感染相关性肝细胞肝癌中表达失常已见报道，但其在HCV感染相关性HCC中的表达情况及病理功能仍未阐明。本课题旨在探讨 miR-152在HCV感染相关性HCC中的抑癌功能以及HCV核心蛋白诱导miR-152下调促进HepG2异常增殖的分子机制。方法：重组HCV核心蛋白腺病毒（Ad-HCV core）感染人肝癌HepG2细胞，SYBR探针荧光定量PCR检测HepG2-HCV core细胞中miR-152和Wnt1 mRNA表达的变化；Western blot检测Wnt1蛋白表达水平变化；MTT、流式细胞术和克隆形成实验检测细胞增殖；分别用miR-152 inhibitor和miR-152 mimics转染HepG2细胞后，SYBR探针荧光定量PCR检测HepG2-HCV core细胞中miR-152和Wnt1 mRNA表达的变化；Western blot检测Wnt1蛋白表达水平变化；MTT法、流式细胞术和克隆形成实验检测对HepG2细胞增殖的影响；构建针对WNT1 3'-UTR的荧光素酶报告基因载体，并检测各实验组荧光素酶活性。结果：HCV核心蛋白可显著抑制miR-152并促进Wnt1表达，同时促进HepG2细胞异常增殖。miR-152抑制剂转染可促进细胞增殖，而miR-152类似物转染可抑制细胞增殖。荧光素酶活性分析、FQ-PCR 和western blot实验同时证实Wnt1 是miR-152的一个重要靶基因。Ad-HCV core 感染 HepG2细胞24h后通过miR-152类似物转染恢复miR-152表达后几乎可完全逆转HCV核心蛋白对HepG2细胞的促增殖效应；同时下调Wnt1 mRNA 和蛋白表达至基础水平。 结论：HCV核心蛋白可能通过抑制miR-152而上调Wnt1致Wnt信号通路激活，导致肝癌细胞恶性增殖。miR-152具有抑制肝癌细胞增殖的治疗潜能。