Igf2基因内含子miRNA多通路调控心脏衰老的分子机制研究

Cardiovascular disease is a serious threat to the health of the elderly.To effectively prevent heart cells from damage is a key strategy for the treatment of heart aging. The applicant's previous study found that: Overexpression of miR-483-5p can inhibit neovascularization function of endothelial cells, we predicted and verified the protecting protein of heart SRF is miR-483-5p directly binding target gene. Meanwhile, compared with the wild group, the tissue electron microscopy result of aging miR-483-5p transgenic mouse heart showed obvious damage of cardiac cells and endothelial cells. Pursuant to which the group proposed assumptions: miR-483-5p is a negative regulatory factor of myocyte and endothelial cell’s function, and controls cell senescene during heart aging process. This project intends to carry out the following work: Using over-expression and knock-down of miR-483-5p transgenic mice to reveal the function of miR-483-5p on cardiomyocyte and endothelial cell during heart aging in vivo; by the cellular level, to clearify how miR-483-5p controls cell senescence process mechanism; prediction and validation of miR-483-5p multiple target genes in cell senescene. The significance of this project is to provide a new target for the treatment of cardiovascular disease and theoretical basis.

心血管疾病已严重威胁老年人健康，有效保护心脏组织细胞从而延缓心脏衰老是治疗的关键策略之一。申请人前期研究首次发现：在血管内皮细胞中过表达miR-483-5p可抑制细胞形成新生血管能力；心脏保护蛋白SRF是miR-483-5p的靶基因；衰老的miR-483-5p过表达转基因小鼠心脏电镜结果发现心肌细胞和内皮细胞损伤。据此本课题组提出假设：miR-483-5p是心肌细胞和微血管正常功能的负向调控因子，可在通过调控细胞衰老机制引起细胞功能障碍，引发心脏疾病。本课题拟进行如下工作：利用过表达及敲减miR-483-5p转基因小鼠，在体内水平揭示miR-483-5p在心脏衰老中对心肌细胞和内皮细胞功能的影响；通过细胞水平实验，明确miR-483-5p控制细胞衰老分子机制；预测并验证miR-483-5p在细胞衰老多个通路中的不同靶基因。本项目意义在于为心血管疾病的治疗提供新的靶点和理论依据。

背景：心血管疾病已严重威胁老年人健康，有效保护心脏组织细胞从而延缓心脏衰老是治疗的关键策略之一。申请人前期研究首次发现：在血管内皮细胞中过表达miR-483可抑制细胞形成新生血管能力；心脏保护蛋白SRF是miR-483的靶基因；衰老的miR-483过表达转基因小鼠心脏电镜结果发现心肌细胞和内皮细胞损伤。据此本课题组提出假设：miR-483是心肌细胞和微血管正常功能的负向调控因子，可在通过调控细胞衰老机制引起细胞功能障碍，引发心脏疾病。主要研究内容：使用高血糖这一衰老因素，制作糖尿病小鼠模型，检测小鼠心肌中miR-483表达变化；体外实验采用大鼠心肌细胞H9c2，经高糖环境模拟培养后检测miR-483含量表达变化。使用得功能gain-of-function的方法，制作过表达miR-483转基因小鼠。使用Realtime PCR方法，鉴定miR-483转基因小鼠心脏组织中miR-483的表达含量。体内实验取转基因与野生型小鼠糖尿病造模后的心肌组织，采用组织化学染色检测心肌细胞肥大及心肌纤维化程度，采用TUNEL凋亡实验检测高血糖环境下心肌细胞凋亡情况。在H9c2中过表达及敲减miR-483后，采用流式细胞检测术检测高血糖环境下细胞凋亡情况。在H9c2细胞中转染miR-483后检测靶蛋白IGF-1的表达以及凋亡保护蛋白Bcl-2的表达水平。构建携带IGF-1基因3’UTR 的过表达质粒应用双荧光素酶(dual luciferase)报告基因技术验证miR-483-3p对预测靶点SRF表达的转录后抑制作用。重要结果：STZ腹腔注射成功诱导糖尿病小鼠模型。糖尿病小鼠心脏内miR-483-表达水平明显上升。体外实验证实H9c2细胞经高糖处理后mi-483表达水平上升。在H9c2中过表达miR-483可促进体外高糖环境下细胞凋亡。确定miR-483可通过与靶基因IGF-1mRNA的3’UTR结合发挥功能。科学意义：通过高糖这一衰老因素刺激心肌细胞，心肌细胞中miR-483表达上升。过表达miR-483后明显在体内及体外促进高糖诱导造成的心肌细胞损伤及凋亡。