基于合成生物学技术获得新型结构核苷肽类化合物的研究

Sansanmycins, first isolated by our institute in 2007, are nucleosidyl-peptide antibiotics with antibacterial activities against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis and Pseudomonas aeruginosa. Sansanmycins are one of the lead compounds for the development of new anti-tuberculosis drugs due to their unique chemical structures, novel antimicrobial mechanism and narrow antibacterial spectrum. But the weak antibacterial activities make it an urgent need to modify sansanmycins to improve their druggability. However, modification via chemical methods is very difficult because of its special configuration and complex chemical structures. Based on the knowledge of the biosynthetic mechanisms of sansanmycins and other nucleosidyl-peptide antibiotics, synthetic biological technologies will be employed to obtain novel nucleosidyl-peptide compounds. In this research, the genetic elements of biosynthetic gene clusters of sansanmycins and nikkomycins will be reconstructed in heterologous host Streptomyces coelicolor and the reconstructions will be optimized by changing the promoters and synthetases responsible for the amide formation. The results in this research will not only provide novel nucleosidyl-peptide compounds but also offer a new method for developing novel anti-tuberculosis drug candidates.

Sansanmycins是2007年由本所首次分离得到的具有抗多重耐药结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌活性的核苷肽类抗生素，其作用机制新颖、化学结构独特、抗菌谱窄，是寻找新型抗结核药物的先导化合物之一。但它的抗菌活性不高难以成药，同时其分子立体构型的特异性和化学结构中存在的多个活泼基团使得通过化学改造提高其成药性非常困难。本项目在前期对sansanmycins生物合成机制研究的基础上，首次利用合成生物学技术在异源宿主天蓝色链霉菌中将其生物合成基因簇中的遗传元器件与具有抗真菌活性的核苷肽类抗生素nikkomycins生物合成基因簇中遗传元器件进行有目的的重构，并通过改变启动子以及负责相关酰胺键形成的酶来优化重构方式，期望产生具有新型结构和更优活性的核苷肽类化合物。本项研究利用合成生物学技术有可能获得新型核苷肽类化合物，在为新药创制提供新的候选药物方面具有重要意义。

Sansanmycins是2007年由本所首次分离得到的具有抗多重耐药结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌活性的核苷肽类抗生素，其作用机制新颖、化学结构独特、抗菌谱窄，是寻找新型抗结核药物的先导化合物之一。但它的抗菌活性不高难以成药，同时其分子立体构型的特异性和化学结构中存在的多个活泼基团使得通过化学改造提高其成药性非常困难。本项目在前期对sansanmycins生物合成机制研究的基础上，将其生物合成基因簇导入天蓝色链霉菌中实现异源表达，并且将具有抗真菌活性的核苷肽类抗生素nikkomycins生物合成基因簇分别在天蓝色链霉菌和sansanmycin产生菌中实现异源表达，可惜的是在sansanmycin产生菌中未产生sansanmycins与nikkomycins结构相互杂合的新化合物，并且经生物信息学分析二者自然杂合重组的可能性较小，因此调整策略以突变生物合成为主，构建ssaX阻断突变株，利用非核糖体肽合成酶的底物宽容性，通过突变生物合成获得20多种sansanmycin衍生物，丰富了N-末端氨基酸的结构多样性，对其中10个化合物进行了分离纯化和结构鉴定，均为首次报道的新结构。测定了5个化合物的抗结核活性，均与母化合物sansanmycin A相当，尤其值得注意的是它们对临床上的多重耐药（MDR）和广泛耐药的结核分枝杆菌（XDR-TB）也具有相当的抗菌活性。同时，sansanmycin MX-2和MX-4 比sansanmycin A更稳定。接着利用同样地策略对sansanmycin结构中的尿苷结构进行改造，在原产生菌中成功构建ssaK、ssaE、ssaM阻断菌株，阻断尿苷的生物合成，利用LC-MS检测到预测的中间产物，正在进行底物类似物的饲喂以及异源核苷生物合成元件的导入。与此同时选取文献报道的多种启动子插入sansanmycin途径特异性调控因子ssaA上游，通过优化启动子提高了sansanmycin类化合物的产量，为后续新结构化合物的产生提供了强有力的保障。本项目首次利用突变生物合成技术对尿苷肽类化合物sansanmycin进行结构改造，成功获得成药性改善的新型核苷肽类化合物，同时本项目构建的阻断菌株是非常合适的“细胞工厂”，通过底物饲喂或导入挖掘到的新颖的生物合成元件有望获得多种新型核苷肽类化合物，在为新药创制提供新的候选药物方面具有重要意义。