棉铃虫及近缘种性信息素受体结构与功能的关系

Because of the surprisingly high specificity of communication signals and responses within a species in moths and the clear differentiation in signaling systems among species, the reproductive isolation has been presented within closely related species. However, little is known about the present molecular mechanisms that underlie the differentiation of evolution between closely related species. Firstly, Heliothis-homologous pheromone receptor candidates are identified using antennal transcriptomes and cloned in our research. Then, the functional properties of some of these pheromone receptor genes in the heterologous expression system of Xenopus oocytes are characterized with an oocyte clamp. Secondly, we find that male moths identify the difference of sex pheromone blend produced by conspecific females within four closely related species. According to highly homologous among OR6 amino acid sequences of sex pheromone receptor, the mutant sequences are obtained using site-directed mutagenesis. Then, functional identifications are performed using expression systems of both Xenopus oocytes in vitro and transgenic flies in vivo. Eventually, key structural sites combining with sex pheromone components will be sought. In a word, this work will elucidate the relationship between structure and function of sex pheromone receptor. It will also contribute to reveal the cause of reproductive isolation among closely related species in moths.

鳞翅目蛾类性信息素通讯系统信号的高度特异性以及物种之间对这种信号反应的差异使得不同种间存在着生殖隔离，但目前这种进化差异的分子机制尚不清楚。本项研究通过分析触角转录组，获得棉铃虫及其近缘种性信息素受体OR6基因并对其进行分子克隆；利用爪蟾卵母细胞进行体外表达，结合电压钳技术鉴定受体功能；从夜蛾科4种近缘种雄虫对其雌虫产生的性信息素成分的识别差异入手，根据近缘种间性信息素受体OR6氨基酸序列的高度同源性，利用定点突变技术获得突变序列，通过爪蟾卵母细胞体外表达系统和转基因果蝇体内表达系统对其进行功能验证，寻找与性信息素成分相结合的关键结构位点，解析性信息素受体结构与功能的关系，有助于揭示蛾类近缘种之间产生生殖隔离的原因。

鳞翅目蛾类性信息素通讯系统信号的高度特异性以及物种之间对这种信号反应的差异使得不同种间存在着生殖隔离，但目前这种进化差异的分子机制尚不清楚。本研究首先利用触角转录组对棉铃虫等近缘种性信息素受体基因进行了鉴定。我们克隆了棉铃虫及近缘种性信息素受体OR6基因的全长开放阅读框序列，并将它们分别克隆到体内和体外表达载体上。在体外表达系统Xenopus oocyte中利用双电极电压钳技术对所有受体的功能进行分析，在体内利用转基因果蝇表达系统结合单细胞记录的方法进行功能验证。结果表明，棉铃虫HarmOR6和烟青虫HassOR6均能够被性信息素成分Z9-14:Ald, Z9-16:Ald和以及性信息素类似物Z9-14:OH, Z9-16:OH等所激活，同源受体OR6的功能在种间分化较小。而HvOR6和HsOR6的直系同源性信息素受体OR6发生了明显的功能分化。其中，HvOR6主要结合Hv的次要性信息素成分Z9-14:Ald；而HsOR6主要结合Hs的性信息素次要成分Z9-16:Ald。因此，选取HvOR6和HsOR6为研究对象，进一步阐明影响近缘种性信息素通讯系统差异的关键氨基酸结合位点。通过比对HvOR6和HsOR6氨基酸序列，结果显示两个基因的序列有81个氨基酸差异位点，序列一致性为81.21%。我们初步选择位于胞外区和跨膜区域的氨基酸作为候选的靶标位点进行定点突变。结果显示，7个氨基酸位点能够显著降低HvOR6对配基Z9-14:Ald的反应。因此，我们推测这些氨基酸可能参与了Z9-14:Ald结合口袋的形成。通过比较突变体功能我们发现3个氨基酸参与了HsOR6功能的变化。进一步功能验证发现仅氨基酸321能够影响HsOR6对配基的结合。通过反向突变，我们进一步证实了该氨基酸位点在Hv中对配基的反应特异性发生显著性改变。因此，我们认为氨基酸321参与了两个受体对两个配基的结合特异性，是受体功能分化的关键位点。本研究解析了性信息素受体结构与功能的关系，为揭示蛾类近缘种之间产生生殖隔离的原因提供理论依据。