猪圆环病毒与细小病毒复合空衣壳样粒子的分子设计组装及其免疫原性研究

猪圆环病毒2型（PCV2）与细小病毒(PPV)是严重危害我国养猪业的两种重要病毒，主要引起繁殖障碍与多系统衰竭综合症，在临床上表现为混合感染的特征。目前，对这两种病免疫机理与防制产品的研究是近年来的热点。本研究旨在研究一种复合型的空衣壳样结构，该复合型空衣壳结构包含有PCV2与PPV的主要免疫原蛋白，以此为抗原免疫猪，研究其针对这两种病毒的保护性免疫应答。计划采用两条路线来设计表达复合型的空衣壳结构：路线一是以PPV或者PCV2衣壳蛋白为骨架，嵌入PCV2或PPV的主要T/B细胞表位；路线二是通过一柔性结构将PCV2的ORF2蛋白与PPV VP2蛋白相连，形成两个空间上独立但相联的复合型空衣壳结构。采用原核与昆虫细胞表达融合基因，表达产物纯化后测定其空衣壳结构的形成。测定免疫猪的细胞与体液免疫水平，评价空衣壳结构对两种病的免疫效果，为解决我国猪病多，免疫难度大的实际问题提供理论与技术支持。

猪圆环病毒 2 型（PCV2）与猪细小病毒（PPV）是两种重要的DNA病毒，主要引起母猪的繁殖障碍及仔猪免疫功能紊乱。两种病毒的衣壳均主要由一种蛋白组成，形成二十面体对称的病毒衣壳结构。本研究中以口蹄疫病毒（FMDV）中和表位为模式表位，分别插入或置换PCV2与PPV的不同柔性环区域（Loop），以探讨不同位置替换对VLPs结构组装的影响，研究嵌合异源表位PCV2或PPV VLPs的构建条件，为嵌合表位VLPs疫苗的研究奠定基础。.将异源表位分别插入或置换PCV2 N端信号序列（NLS）、CD、EF、GH环与三个loop均替换为FMDV中和表位，构建5种嵌合表位PCV2衣壳蛋白，分别命名为ORF2-VP1(N)，ORF2-VP1(CD)，ORF2-VP1(EF)，ORF2-VP1(GH)，ORF2-VP1(All)。小鼠免疫试验结果显示：N端嵌合中和表位未能诱导小鼠产生FMDV特异性中和抗体，N端不适合嵌合FMDV B细胞表位；而CD、EF 或GH loop单独替换的3种嵌合表位PCV2衣壳蛋白产生了低水平的FMDV中和性抗体；3个loop都替换的PCV2衣壳蛋白免疫后产生了较高水平的FMDV中和性抗体；添加 Poly（I:C）对中和性抗体的应答有抑制作用（P<0.05）。对PCV2抗体应答检测显示，EF环替换后对PCV2的抗体应答影响最大，提示EF环可能是PCV2的主要免疫显性抗原表位。.将异源表位分别插入PPV VP2蛋白的N端，loop1，loop2，160位与548位后五个不同位点，研究VLPs组装效率。在昆虫细胞表达结果表明：N端缺失20 aa后可插入34个氨基酸（aa）的T细胞表位、Loop 2缺失20 aa后可插入29 aa的中和表位，不影响形成VLPs结构；VP2 160位置可插入23 aa的表位，但VLPs组装效率下降。而Loop 1与C端嵌合口蹄疫中和表位后观察到VLPs。进一步拓展了对PPV 衣壳蛋白中可嵌合异源表位位置的认识，为未来嵌合表位VLPs的分子设计，提供了有价值的研究数据。.PCV2衣壳蛋白复性后，表现出不同于一般蛋白的免疫特性，加入Poly（I:C）后反而抑制了抗体应答，其机理还有待进一步研究，由于表达的嵌合表位PCV2衣壳蛋白的复性效果差，未能观察VLPs结构，后续还将在昆虫细胞中表达，研究VLPs的组装效率与免疫效果。