TET介导的DNA主动性去甲基化与基因组多样性

The methylation of mammalian genome is an important epigenetic marker and the active cytosine demethylation at CpG site is mediated by TET dioxygenase during embryonic development. TET catalyzes the conversion of 5-methylcytosine eventually to 5-carboxylcytosine, and then the base excision repair pathway removes 5-carboxylcytosine and restores cytosine, finishing the active DNA demethylation. But if the active DNA demethylation during the life cycle of mammals can induce mutagenesis in flanking regions, this process increases the diversity of mammalian genome. Our previous study with shuttle vector plasmids containing in-vitro made DNA lesions found that the base excision repair pathway was mutagenic to flanking DNA. Based on this, we propose to further study whether the active DNA demethylation mediated by TET can induce mutagenesis in flanking genomic DNA and mainly focus on the following three aspects. 1) Active DNA demethylation at specific genomic locations, 2) Mutation determination in the regions flanking to active DNA demethylation sites, 3) Mutation signature analysis in the CpG flanking regions of mammalian genome. This research aims to reveal the mutagenic mechanism of TET-mediated active DNA demethylation and explore its role during the evolution of mammals.

哺乳动物基因组甲基化修饰是重要的表观遗传学标志，胚胎发育过程中CpG位点发生的胞嘧啶主动性去甲基化主要由TET氧化酶介导。5-甲基胞嘧啶经TET催化生成终产物5-羧基胞嘧啶后，DNA碱基切除修复通路切除5-羧基胞嘧啶并恢复胞嘧啶，从而完成主动性去甲基化。若哺乳动物生命周期中的DNA主动性去甲基化能引起旁侧序列突变，则可增加哺乳动物基因组多样性。申请人前期工作利用含外源性DNA损伤的质粒载体研究发现，质粒载体上的DNA碱基切除修复过程可引发旁侧序列突变。基于此，本项目拟探索TET介导的内源性染色体DNA主动去甲基化能否产生旁侧序列突变并增加基因组多样性，主要开展⑴染色体DNA特定位点主动性去甲基化、⑵染色体DNA主动性去甲基化位点旁侧序列突变检测、⑶哺乳动物基因组CpG位点旁侧序列突变印迹分析，旨在阐释TET介导DNA主动性去甲基化引发突变的分子机制，并揭示这一过程在哺乳动物进化中的作用。

受本项目资助，我们利用CRISPR/Cas9技术对细胞基因组DNA甲基化状态进行调控，成功构建了可在细胞染色体DNA特定位点引发主动性去甲基化的实验体系；并利用已经构建完成的CRISPR/Cas9技术对细胞基因组DNA甲基化状态进行调控，在染色体DNA特定位点引发加甲基以及主动性去甲基化修饰。发现DNA甲基化修饰可抑制胞嘧啶脱氨酶APOBEC所催化胞嘧啶脱氨产生尿嘧啶的反应，在此基础之上创建了可在基因组高甲基化区域内介导高效碱基编辑的普适型碱基编辑器等新型基因编辑系统；并发现基因组DNA中的单链断裂修复过程可引起旁侧序列的突变以及机制。此外，我们在相关新领域也有所拓展，构建了多种新型碱基编辑器并比较了其能效差异。受本项目资助已发表研究论文8篇（Nature Structural & Molecular Biology、Nature Biotechnology、Cell Research、Genome Biology等，其中综述论文3篇，SCI收录6篇）；本课题组成员参加国际或全国性学术会议18人次。课题负责人陈佳研究员2018年入选中国科学院分子细胞科学卓越创新中心“青年骨干”和国家优秀青年，获2019年上海市“浦江人才计划”终期评估优秀，2019年获上海市生物化学与分子生物学会青年新锐奖，2016-2019年度蝉联上海科技大学“优秀教师”荣誉称号；进一步主持了国家自然科学基金面上项目、优秀青年项目和国家重点研发计划课题；并受邀在重要国际学术会议作专题报告5次。