磷脂酰丝氨酸调节细胞膜流动性和Na+/H+逆向转运体活性参与植物耐盐反应的研究

Cellualr membranes play very important roles in plant response to salt stress. Phosphatidylserine (PS) as the highest accumulated components of phospholipid in plant under salt stress, is confirmed to regulate the fluidity of cellular membrane and activities of channels and transporters. However, little is known about its functions on abiotic stress, especially on salt stress. Comparing the glycophyte Arabidopsis with the halophyte Salicornia europaea, their phosphatidylserine synthase genes (PSS) are both significantly up-regulated under salt stress, coupling with changes on activities of channels and the polarization of plasma membrane. Therefore, we speculate that PS participates in the response of plant to salt stress attributed by regulating the activities of antiporters embeding in membrane. To verify our inference, we first investigate whether application of exougenous PS confers plant enhanced salt tolerance. Then, we plan to use Arabidopsis atpss mutant and silence the endogenous SePSS in S. europaea to confirm the important role of endougenous PS concerntration in salt tolerance of glycophyte and halophtye plants. Especially, the function analysis of PS is carried out to compare the difference between Arabidopsis and S. europaea on fluidity of plasma membrane and tonoplast and activities of SOS1 and NHX1 under different concentrations of NaCl treatments. Through our study, we hope to give more understanding of plant cellular membrane on plant salt tolerance, and propose some new genes to molecular breeding of transgenic plants with enhanced salt tolerance.

动物细胞研究表明磷脂酰丝氨酸（PS）参与膜流动性和通道活性调控。但作为植物在盐诱导下增加最显著的磷脂组分，PS在耐盐响应中的作用还不清楚。比较甜土植物拟南芥和真盐生植物盐角草（Salicornia europaea）发现：在盐处理下，磷脂酰丝氨酸合成酶基因（PSS）表达量都显著上调，并与质膜上的离子通道活性，细胞膜流动性变化是相偶联的。因此，我们推断PS通过调节膜流动性和膜上转运蛋白活性，从而参与植物的耐盐反应。为了验证此推断，我们通过外施PS，考察植物耐盐性的变化。并利用拟南芥atpss突变体和沉默盐角草SePSS，来考察内源PS积累对甜土与盐生植物耐盐的重要性；同时，比较在不同盐浓度下PS对拟南芥和盐角草细胞膜结构及逆向转运蛋白（SOS1和NHX1）活性影响的异同。本研究希望从细胞膜生理功能角度，阐述细胞膜组分与结构对植物耐盐性的影响，为作物耐盐性遗传改良挖掘潜力基因。

盐生植物能够在高盐的生境中正常生长，存在着不同于甜土植物的盐适应机制。由磷脂双分子层和蛋白质组成的细胞质膜，在植物耐盐响应中的作用及其在盐生植物和甜土植物之间的差异，至今还不清楚。本研究中，我们发现盐处理下盐角草与拟南芥质膜的膜脂流动性出现相反的变化趋势；同时，通过膜脂组学，也发现了盐角草和拟南芥发生了不同的质膜膜脂重塑。其中盐角草质膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）百分比较拟南芥出现显著的提高，而调控其合成的磷脂酰丝氨酸合酶基因（S. europeae phosphatidylserine synthase gene，SePSS）在盐处理下表达显著上调。有许多证据表明，膜的极性可以调控膜的流动性；所以，为了研究SePSS功能，我们构建了SePSS过表达和CRISPR/Cas9基因打靶载体，并在盐角草愈伤组织中进行表达。结果显示，在过表达SePSS细胞系中，SePSS转录本显著上升，PS含量也显著增加，并且增强了盐角草在高盐下保持细胞质膜极性的能力；而基因打靶后盐角草细胞，SePSS靶位点出现不同程度的突变，PS含量也降低，细胞质膜在盐下发生明显的去极化，并且打靶的盐角草细胞系在200 mM NaCl处理下出现了敏盐的现象。以上结论说明SePSS通过调控细胞质膜极化参与盐生植物盐角草的适盐反应。进一步，我们比较盐角草SePSS与拟南芥AtPSS1/2功能上的异同，发现他们都参与细胞的PS含量调节和质膜极性的调控，但没有功能上的区别。盐角草Na+/H+逆向转运蛋白，作为重要的耐盐响应蛋白，发现其参与植物的耐盐性和抗病性的调节。而且SeNHX1功能的实现与细胞内pH值以及膜的通透性相关。施加膜流动调节剂苯甲醇（benzyl alcohol，BA），盐角草细胞表面出现Na+流紊乱，同时表现出盐敏感性。综上所述，盐角草 SePSS基因调控PS的合成，参与膜极性和流动性的维持，从而调控SeNHX1功能来影响植物的抗盐性。本工作可以为以后利用基因工程改造植物从而提高盐碱地的利用效率提供理论指导。