去糖基化修饰CREBH阻断非酒精性脂肪性肝炎的发生与发展

cAMP-responsive element-binding protein H (CREBH) plays a crucial role in the regulation of lipid metabolism and the induction of inflammatory response; however, the role of CREBH in non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is not well known. Our preliminary study showed that CREBH was highly expressed and activated in cell culture and animal models of NAFLD. Besides, bioinformatics prediction showed that CREBH was a liver-specific transcription factor, enriched in liver and might regulate Stearyl-CoA desaturase-1 (SCD-1) and Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) expression to enhance hepatic lipotoxicity and inflammation, contributing to the onset and progression of NASH. Therefore, this project is to investigate roles and molecular mechanisms of CREBH in animal and cell models of NASH using virus transfection and molecular biology technologies, and to promote CREBH deglycosylation and suppress its acivation by gene mutation and enzymatic methods. Our project may provide new theoretical and experimental basis for blocking the occurrence and progression of NASH.

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白H（CREBH）参与调节脂质代谢并介导炎症反应，但其与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的关系尚不清楚。我们课题组在前期工作中发现CREBH在非酒精性脂肪性肝病的细胞和动物模型中的表达和活化水平均显著升高，结合生物信息学检测显示CREBH主要富集于肝脏，为肝特异性转录因子，在NASH中的作用极有可能是通过调控硬脂酰辅酶A脱氢酶-1（SCD-1）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的表达，而增加肝脏的脂毒性和炎症反应。因此，本课题以CREBH做为切入点，选用NASH细胞和动物模型，通过病毒转染及分子生物学技术，明确CREBH在NASH中的作用及其机制，并利用基因突变及酶学方法去糖基化修饰CREBH，抑制其裂解活化，为阻断NASH的发生与发展提供新的理论和实验依据。

CREBH 是位于染色体 19p13.3 上的 CREB3L3 基因编码的内质网膜锚定蛋白，该蛋白主要富集于肝脏，属于肝特异性转录因子，可参与调节脂质代谢并介导炎症反应，但其与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的关系尚不清楚。结合我们前期研究基础和生物信息学软件分析结果，我们认为CREBH在NASH中的作用极有可能是通过调控硬脂酰辅酶A脱氢酶-1（SCD-1）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的表达，从而增加肝脏的脂毒性和炎症反应。鉴于此，本课题选用NASH细胞和动物模型，利用病毒转染及分子生物学技术，构建基因敲除小鼠模型，并利用基因突变及酶学方法糖基化修饰CREBH调节其生物活性，以明确CREBH在NASH发生发展中的作用及具体机制。在体外研究中，我们首先证实 PA 和氧化应激信号均可激活肝细胞中的CREBH，促使N-CREBH表达明显增加，可在肝细胞炎症损伤中发挥潜在保护作用。利用ChIP实验进一步证实在小鼠肝细胞系AML-12 内CREBH 能与SCD-1和MCP-1的启动子序列直接结合，并增强 SCD-1 的转录活性且同时抑制MCP-1的转录。同时，我们在AML12中构建了多种CREBH的糖基化修饰突变体，发现非糖基化及去糖基化修饰 CREBH均促使脂质代谢紊乱、脂毒性、炎症和脂质过氧化失调从而加重肝细胞脂肪变，而对CREBH的高糖基化修饰则对肝细胞脂肪变起一定的保护作用。在体内实验中，我们通过尾静脉注射过表达CREBH的腺相关病毒载体上调小鼠肝组织内CREBH的表达后，发现两种饮食（MCD饮食和HF饮食）诱导的NASH模型小鼠肝组织损伤、炎症反应、纤维化程度均得到显著缓解，同时伴有多种脂质代谢指标和炎症指标的改善，而敲除CERBH基因的小鼠肝脏病理学则显著加重且伴有上述指标的表达增加。通过小鼠尾静脉注射LV-CREBH m1+m2+m3及LV-GnT-V慢病毒表达载体对肝组织中的CREBH进行非糖基化和高糖基化修饰，发现CREBH非糖基化修饰可加重NAFLD肝脏脂质沉积和炎症反应，而高糖基化修饰CREBH则可逆转这些病理改变。这些体内外研究结果表明高糖基化修饰CREBH可通过转录调控MCP-1和SCD-1在NASH的发生发展起到一定的保护作用。总之，本课题明确了CREBH基因在NASH中的保护作用，为临床诊治 NAFLD 提供了新的理论和实验依据。