基于GlcNAc6P特异性磷酸酶定向筛选与进化的N-乙酰氨糖生物合成研究

N-acetylglusosamine (GlcNAc) finds a variety of applications in healthcare food and pharmaceutical fields. In previous work, the applicant achieved the initial accumulation of GlcNAc in Bacillus subtilis by rational design of GlcNAc synthesis pathway and modular assemble of metabolic networks, and further identified the dephosphorylation reaction of N-acetylglucosamine-6-phosphate (GlcNAc6P) as a rate-limiting step by 13C labeling based dynamics analysis of GlcNAc synthesis pathway. However, GlcNAc6P specific phosphatase is unknown and never reported. In this project, with the glucose phosphatase YigL from E. coli as the initial target protein, the applicant attempts to accelerate the dephosphorylation reaction of GlcNAc6P and improve GlcNAc synthesis rate by construction of GlcNAc6P specific phosphatase screening system and mutant library generated by directed evolution of YigL, and analysis of catalytic dynamics and structure-function mechanism, and overexpression of the obtained GlcNAc6P specific phosphatase via chemical induced chromosome engineering. The research strategies and idea used in this project are not only useful for the screening and molecular engineering of the other substrates specific phosphatase, but also are of academic value for the studies of the unknown pathway enzymes in the metabolic engineering.

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)在健康保健领域具有广泛应用。前期研究中，申请人通过GlcNAc合成途径理性设计与模块组装策略构建了一株具有较高GlcNAc合成效率的B.subtilis菌株，并利用基于13C同位素标记的反应动力学分析确定GlcNAc6P的去磷酸反应为GlcNAc合成的限速步骤，而GlcNAc6P特异性磷酸酶未见报道。由此，本项目以来自E. coli的葡萄糖-6-磷酸酶YigL为出发蛋白，通过GlcNAc6P特异性磷酸酶高效筛选系统设计、定向进化构建突变体文库和目标蛋白筛选、体外催化动力学分析和构效关系的分子机制解析、目标蛋白多拷贝整合表达等策略提高GlcNAc6P去磷酸反应速率，促进GlcNAc高效合成。所采用的研究思路和方法对其他底物特异性酶的高效筛选和构效关系解析具有一定参考价值，同时对代谢工程中未知途径限速酶的调控研究亦具有一定借鉴意义。

N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）在食品、保健品及药品领域有着广泛的应用。6-磷酸乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc6P）的去磷酸化反应是 N-乙酰氨基葡萄糖合成过程中的限速步骤，而GlcNAc6P特异性磷酸酶未见报道。因此，本项目以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为研究对象，通过筛选GlcNAc6P的特异性磷酸酶；结合系统代谢工程与合成生物学的相关技术手段，增强GlcNAc合成前体GlcNAcP积累；强化磷酸酶表达，提高GlcNAc产量三个方面展开研究。.首先，通过KEGG数据库比对，筛选验证得到关键磷酸酶YwpJ，通过表达磷酸酶YwpJ，使胞内的GlcNAc6P去磷酸化生成GlcNAc，有效促进了GlcNAc的合成；然后，利用glmS核酶突变体M9控制关键基因葡萄糖6磷酸异构酶基因pgi的表达进一步提高GlcNAc产量；接着，利用启动子、glmS核酶突变体、RBS元件进行组合优化pgi的表达，使重组菌株的GlcNAc产量增加至18.45 g/L；最后，结合转录组学技术阐明了磷酸酶YwpJ解除因GlcNAc6P积累导致的磷酸糖胁迫的作用机制，并通过过表达磷酸酶YwpJ解除磷酸糖胁迫细胞生长的抑制作用，最终GlcNAc产量达到87.5 g/L。.综上所述，本项目通过数据比对分析结合CRISPR技术筛选了一个GlcNAc6P特异性磷酸酶YwpJ；利用系统代谢工程和合成生物学技术强化了GlcNAc合成前体GlcNAc6P的积累；通过转录组分析阐明了磷酸酶YwpJ参与的磷酸糖胁迫响应机制，并最终显著提升了 GlcNAc 的合成能力和细胞的生理性能，为工业化生产GlcNAc奠定了基础。基于上述研究，发表SCI论文10篇；出版著作2部；获授权中国专利2项，国际专利1项。