基于VEGFR1探讨阻断脑膜炎大肠杆菌穿过血脑屏障的新策略

大肠杆菌穿过血脑屏障是脑膜炎发病的关键环节。申请者在完成国家自然科学基金青年基金的过程中，首次发现表达在人脑微血管内皮细胞（HBMEC）上的血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）参与了大肠杆菌侵袭HBMEC（Infect Immun.2010,78:4809-16）。最近我们发现，VEGFR1胞外段重组蛋白对大肠杆菌进行预处理后能够明显减少大肠杆菌穿过血脑屏障。本项目拟鉴定VEGFR1胞外段中与大肠杆菌侵袭HBMEC相关的关键肽段（活性位点），分析其涉及的细胞内信号通路；然后在大肠杆菌中寻找与VEGFR1胞外关键肽结合的外膜蛋白/配体；在此基础上，制备针对VEGFR1胞外关键肽的特异性抗体，体外和体内实验分析该抗体对VEGFR1与其配体相互作用所介导的大肠杆菌穿过血脑屏障的影响。本项目的完成将推进对于大肠杆菌侵袭血脑屏障分子机制的认识，可望为大肠杆菌性脑膜炎防治策略的研究提供新的科学思路。

负责人的前期研究显示，血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）可能作为宿主细胞表面受体，参与大肠杆菌K1株（E. coli K1）侵袭人脑微血管内皮细胞（HBMEC），本项目拟阐明VEGFR1参与E. coli K1侵袭脑微血管内皮细胞的分子机制，并尝试通过阻断VEGFR1功能来阻止细菌侵袭血脑屏障。主要研究进展：（1）发现VEGFR1胞外段328-758aa是VEGFR1参与E. coli K1侵袭HBMEC的关键结构域。利用DNA重组及蛋白质体外表达技术，获得了VEGFR1(1-327aa)及 VEGFR1(328-758aa)纯化蛋白，发现VEGFR1(328-758aa)与E. coli K1共孵育后，抑制了细菌侵袭HBMEC，说明VEGFR1的328-758aa对于VEGFR1参与细菌侵袭HBMEC是必须的；（2）鉴定了细菌侵袭过程中VEGFR1下游的信号通路，即VEGFR1活化后引起细胞内PI3K/Akt信号的激活，并导致小分子GTP酶Rac1的活化，使细胞膜边缘的肌动蛋白微丝重新组装，继而使细菌进入HBMEC内；（3）在E. coli K1中筛选到了VEGFR1的结合配体OmpA。获取E. coli K1的外膜蛋白，与含有GST标签的VEGFR1(328-758aa)纯化蛋白共同孵育，将pull-down组分进行蛋白质飞行质谱分析，结果筛选到多个候选的VEGFR1的细菌配体，进一步研究显示，VEGFR1能够与OmpA蛋白发生相互作用，提示OmpA即为VEGFR1在细菌中的配体；（4）获得了针对VEGFR1(328-758aa)的单克隆抗体，将该抗体与HBMEC进行预先孵育后，发现该抗体可以降低E. coli K1对HBMEC的侵袭；以上这些结果正在整理数据准备投稿。（5）相关的探索性研究发现:（a) 胞浆型磷脂酶A2α参与了阪崎肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞，结果已发表于Biochem Biophys Res Commun（2012;417(3):925-30）；（b）E. coli K1能够侵袭进入神经元，且与HBMEC上的Caspr1受体相关；（c）ephrin-A3和ephrin-A4参与HBMEC的血管生成过程，结果已发表于Anat Rec (Hoboken). 2014;297(10):1908-18。