鼻咽癌循环肿瘤细胞的单细胞转录组学分析

Circulating tumor cells (CTC) may play an important role in tumor metastasis, which is one of the main reasons for failure of tumor treatment. Evidence suggested that the current approaches of enrichment and identification of CTC is not sufficient. Recognizing CTC by the epithelial phenotype will lead to miscalculation of normal circulating epithelial cells and losing the CTC undergoing epithelial mesenchymal transition (EMT), thereby limiting the clinical utility of CTC, and bringing bias to the characterization of CTC at single cell level. Almost 100% of the nasopharyngeal carcinoma patients in Southern China are Epstein-Barr Virus (EBV) positive. Taking advantage of this feature, EBV could be a marker for distinguish the real NPC CTC and analyze the biological character of CTC. In this study, we aim to isolate NPC CTC by immunomagnetic cell sorting assay combined with EBV detection and analyze the single cell transcriptome by Smart-Seq2. From this, we will try to find out the gene expression profiles of NPC CTC, the correlation of CTC number and metastasis, and heterogeneity of CTC. Thus, we can provide better understanding of the biological characteristics and gene expression network of NPC CTC, and explore the specific cell surface markers for NPC CTC used in prediction and therapy.

循环肿瘤细胞（CTC）可能在肿瘤的转移中扮演重要角色。研究发现，现有的CTC分选和鉴定技术仍存在不足，不能完全界定肿瘤细胞，给从单细胞水平的CTC研究带来偏倚。由于中国南方高发区中鼻咽癌（NPC）患者肿瘤细胞中几乎100%的潜伏感染了EBV，利用此特性可分选循环中真正的NPC CTC细胞，并从单细胞水平研究NPC CTC的生物学特性。因此，本课题拟以NPC为模型，结合免疫磁珠分选和单细胞内EBV检测，分离鉴定NPC CTC单细胞，并用Smart-seq2单细胞全长转录组测序技术分析NPC CTC的转录组谱式和特征，从单细胞层面了解NPC CTC的生物学特性和异质性。寻找NPC CTC特异性的分子标记物，探寻与NPC转移相关的关键分子和细胞亚群，从中寻找可用于鼻咽癌的分子诊断、分型和个体化治疗的分子标记和抗肿瘤转移治疗的分子靶标。

循环肿瘤细胞（CTC）可能在肿瘤的转移中扮演重要角色。本课题拟以鼻咽癌 (NPC) 为模型，分离鉴定NPC 循环肿瘤细胞（CTC）单细胞，并用Smart-seq2单细胞全长转录组测序技术分析NPC CTC的转录组谱式和特征。但在项目开展过程中，我们发现从NPC患者外周血中分离获得CTC单细胞数量过少，且测序建库的成功率较低，难以开展单细胞测序工作。因此，我们将研究对象调整为NPC组织，通过单细胞测序技术从单个细胞层面了解NPC生物学特性及异质性，描绘鼻咽癌组织的免疫微环境。本项目首先优化并建立了成熟且高效的NPC单细胞悬浮液制备的实验体系，可实现每个NPC组织制备单细胞悬液时能获得活性高于80%的单细胞，满足Smart-seq2和10× Genomics两种单细胞转录组建库方法的要求。其次，分别利用上述两种建库技术对NPC细胞系和NPC组织进行单细胞转录组测序，均成功构建NPC单细胞 cDNA 文库，为后续测序奠定了良好的基础。进一步分析测序数据，已成功获得NPC细胞系和NPC原发肿瘤组织单细胞转录图谱。基于NPC细胞系测序结果，我们发现即使在鼻咽癌细胞系这类高度均一化的细胞群体中，细胞异质性仍然广泛存在；基于NPC原发肿瘤组织测序结果发现鼻咽癌组织浸润的免疫细胞以 T 细胞为主。鼻咽癌组织中发现 KI67 阳性的免疫细胞，反映了在NPC组织中，部分免疫细胞（包括 T 细胞，B 细胞，巨噬细胞）呈现增殖趋势。综上所述，我们的研究成果展示鼻咽癌细胞系中细胞异质性的广泛存在，鼻咽癌组织存在大量免疫细胞浸润，大量免疫细胞表现为不成熟状态的同时，又有少量免疫细胞表现出增殖趋势，体现了肿瘤免疫微环境中的复杂状态，为后续进一步研究提供参考和思路。