小金海棠柠檬酸合成酶家族基因的克隆和功能研究

MxCS1, a citrate synthase gene, is cloned from high adaptable iron-deficiency stress, semi-dwarf apple rootstock Malus xiaojinensis for the first time, which belongs to citrate synthase gene family, with independent intellectual property of China and tight relationship to iron stress. The function of the gene is studied by homologous complementary method on Arabidopsis mutant, other members of the gene family are cloned at the same time. The Real-time, Southern and Northern methords are used to analyze the existence and expression models in Malus xiaojinensis and the influences from iron stress on these genes.Then they are introduced into the model plant tobacco and Arabidopsis, the existence forms are researched in the transgenic plants through molecular analysis. The relevant molecular and physiological determination and morphology observation are done after iron stress of the transgenic plants, which will reveal the function of Malus xiaojinensis citrate synthase family genes on iron transposition in plant. This study would provide not only evidences for iron stress mechanism studies further, theoretical basis for more genetic improvement, enhancing the yield of fruit tree through increasing the iron utilization, but also material basis for breeding iron efficient fruit tree species. So the research and use of this gene family have specifically significance in theory or reality, and favorable infection to participate international competition in resistant material and intellectual property rights for our country.

小金海棠柠檬酸合成酶基因MxCS1是从高抗铁胁迫、半矮化苹果砧木小金海棠中，首次克隆得到、具有我国自主知识产权、与铁营养胁迫相关的柠檬酸合成酶家族基因成员。利用拟南芥突变体同源互补法分析该基因的功能，同时克隆家族其它基因，利用Real-time、Southern和Northern等分子手段分析其在小金海棠中的存在和表达模式，分析铁胁迫处理对其表达的影响。再转入模式植物烟草和拟南芥中，用分子手段分析其在转基因植株中存在形式，铁胁迫处理后进行相关的分子和生理学测定及形态学观察，从而揭示小金海棠柠檬酸合成酶家族基因在植物体铁转运中的功能。 本研究为铁胁迫机理研究提供充分的证据，更为进一步遗传改良果树品种对铁营养的利用，提高产量等提供理论依据，为果树铁高效品种选育提供物质基础。因此对该基因家族的研究无论在理论还是现实生产中都具有一定的意义，也会对我国参与国际抗逆材料的知识产权竞争具有积极的影响。

MxCS1是从高抗铁胁迫半矮化苹果砧木小金海棠中，首次克隆得到的柠檬酸合成酶家族基因成员。本项目利用拟南芥突变体同源互补法分析该基因的功能，结果发现MxCS1基因可以恢复拟南芥突变体CS-1的突变性状达到正常拟南芥性状；同时克隆家族其它基因MxCS2和MxCS3，分别可翻译为含296和235个氨基酸的蛋白，理论分子量为 33.2 和26.3kDa，等电点为7.79和9.47。利用Real-time的方法分析其在小金海棠中表达模式，结果发现其表达丰度较高的部位都在新叶和新根，在木质部最低，且它们的表达均会受到铁胁迫诱导和IAA、ABA处理均呈现显著提高的趋势，但是表达变化幅度和反应速度MxCS3基因 明显高于MxCS2基因，因而MxCS3基因更趋近于该家族的主效基因。亚细胞定位试验结果发现它们均定位在细胞膜和线粒体上。. 构建超表达载体分别转入模式拟南芥中，对转基因拟南芥铁胁迫处理后发现转基因的拟南芥植株对高铁和低铁胁迫的适应性显著提高，且提高了植株中铁元素、叶绿素、柠檬酸的含量，提高了柠檬酸合成酶的活性，在铁胁迫的条件下，转基因植株的鲜重和根长有明显的提高；两个基因转化拟南芥的处理结果发现，MxCS3相对与MxCS2基因来说有更大的改善，更大程度上提高了柠檬酸合成酶的活性，提高铁元素、叶绿素、柠檬酸的含量，从而更大程度地提高转基因植株对铁胁迫的适应能力，因而我们试验结果认定MxCS3相对于MxCS1和 MxCS2来说更趋近于小金海棠柠檬酸合成酶家族基因的主效基因。.在转基因的拟南芥植株中首次发现MxCS3基因可以使转基因拟南芥植株的花构型和数目发生变异，这在MxCS1和 MxCS2的植株中是没有发现的，此前仅发现转化MxCS1烟草植株开花时间和构型的变化，我们测定MxCS1和 MxCS3植株中元素含量变化时也发现铁、锰、铜、锌的含量显著提高，其中在花和新叶中铁和锌的含量变化达到极显著差异，明显得到提高，而转基因植株中的锌指蛋白基因明显增强表达，进而促进了NAC、WRKY等转录因子基因的表达出现变化。. 本研究为铁胁迫机理研究提供充分的证据，为进一步遗传改良果树品种对铁营养利用，提高产量等提供理论依据，为果树铁高效品种选育提供物质基础。因此对该基因家族的研究无论在理论还是现实生产中都具有一定的意义，也会对我国参与国际抗逆材料的知识产权竞争具有积极的影响。