樟树芳樟醇合成酶（LIS）基因家族的克隆及功能鉴定

Linalool, the main component of essential oil in Cinnamomum camphora, has the significant value and wide application foreground because it has anti-inflammatory and analgesic effects, sensitizing effect of cancer chemotherapy, antianxiety effects, repellent and insecticidal effect, etc. Linalool synthase (LIS) family in C.camphora have sevaral members, and play a crucial role in linalool synthesis. The studies of LIS genes in C.camphora have not been reported as so far. In this study, on the base of sequence information of transcriptome and whole genome, the cDNAs and gDNAs of LIS gene families were isolated from C.camphora by molecular biology experimental technology, and the protein structure and evolutionary relationships of LIS gene families were analyzed by bioinformatics software. In addition, and the mRNA expression levels of LIS gene families were studied using quantificational real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Subcellular localization and functional identify were carried out by constructing different expression vectors. The purpose is to clarify the relationship between LIS gene families and linalool synthesis, to reveal the role of family members in different tissues and different developmental stages of C.camphora. The result will provide a theoretical basis for further elucidating the metabolic regulation of linalool synthesis, and provide a real clear genetic resources for breeding and genetic improvement of C.camphora, ultimately to improve the production and quality of essential oil, and to increase social, economic and ecological contribution of natural linalool in C.camphora.

芳樟醇是樟树精油的主要成分，有消炎止痛、肿瘤化疗增敏、镇静抗焦虑和驱避杀虫等多种作用，具有重要的研究和应用价值。樟树芳樟醇合成酶（LIS）基因是一个多基因家族，在芳樟醇的合成过程中起着至关重要的作用。迄今为止，尚未见樟树LIS基因的相关研究报道。本项目基于转录组和全基因组序列信息分析获得LIS基因序列，通过生化与分子生物学手段克隆LIS基因家族代表成员并对其进行结构和进化分析，采用qRT-PCR分析其时空表达模式，并构建原核表达载体和可转化的植物表达载体，对其进行功能鉴定和亚细胞定位，在此基础上，明确LIS基因家族成员的表达与芳樟醇合成的关系，揭示家族成员在不同组织和不同发育时期所起的作用。研究结果将为进一步阐明樟树芳樟醇合成的代谢调控提供理论基础，为樟树的良种选育和遗传改良提供真正明确的基因资源，从而最终提高樟树精油的产量，改善其品质，增加樟树源天然芳樟醇对社会、经济和生态的贡献率。

芳樟醇是樟树精油的主要成分，有消炎止痛、肿瘤化疗增敏、镇静抗焦虑和驱避杀虫等多种作用，具有重要的研究和应用价值。樟树芳樟醇合成酶（Lis）基因是一个多基因家族，在芳樟醇的合成过程中起着至关重要的作用。本项目基于转录组和全基因组序列信息分析获得Lis基因候选序列，通过生化与分子生物学手段克隆Lis基因家族成员，并对其进行生物信息学分析，采用qRT-PCR分析其时空表达模式，并构建原核表达载体和可转化的植物表达载体，对其进行功能鉴定和亚细胞定位研究，为进一步阐明樟树芳樟醇合成的代谢调控提供理论基础。取得的重要结果包括：（1）樟树叶绿体基因组全长152570bp，具有典型的四分体结构，包括两个反向重复区域（IRs）、一个大单拷贝区（LSC，93705bp）和一个小单拷贝区（SSC，19093bp），GC含量为39.13%。该基因组共编码123个基因，共有9 个密码子(UUU、CUU、UCA、ACA、UAU、AAU、GAU、UGA、GGA)被鉴定为樟树叶绿体基因组的最优密码子。（2）樟树Cclis基因家族有4个成员，通过克隆获得4条CcLis基因的全长cDNA序列，分别命名为CcLis1、CcLis2、CcLis3和CcLis4。生物信息学分析显示，4个CcLis基因都含有7个外显子，其中CcLis2与CcLis3同源性最高。（3）CcLis在不同化学型和不同组织中的表达模式差异明显，其中，CcLis4在芳樟中的表达量最高，而在其余四个化学型中的表达相对较低，CcLis4在各组织中的表达量均显著高于其它基因，其表达趋势为嫩茎>幼果>嫩叶>花。推测：CcLis4可能是樟树中合成芳樟醇的关键基因。（4）运用Gateway技术完成了CcLis2（TPS67）、CcLis3（TPS68）、CcLis4（TPS12）和TPS69的植物过量表达载体构建，分别为TPS67::PBI121, TPS68::pH35GS, TPS68::PBI121, TPS12::pH35GS，TPS12::PBI121，TPS69::PBI121， TPS69::pH35GS。采用花序法侵染转化拟南芥，成功将Cclis4-TPS12转入拟南芥中，并获得了阳性转基因植株，为研究芳樟醇的合成调控奠定了基础。