新型变构EPO延迟应用对老龄小鼠脑缺血神经修复作用及机制

The research on protective effect of ischemic by erythropoietin(EPO) is still a research hotspot. We have devoted ourselves to studying how to avoid the side effects of EPO and get the most neuroprotective effects out of it for a long time. Our two grants of National Science Foundation of China is about the neuroprotection of EPO.One is about EPO-TAT which can penetrate the blood brain barrier. The other one is about the administration of EPO via middle cerebral artery. However, there still remains several problems to be solved in our current studies as well as that of other researchers: ① Most animal experiments are performed during acute stage, but clinical endpoint is more closely correlated with convalescence and rehabilitation period. ② Most experimental animals are young or adult, and generally administrated in the early phase of ischemia, which is extremely different from clinical patients. ③ There is boundedness in our previous studies and relevant studies by other researchers. As a result, it is necessary to continue the researches on the neuroprotective effects of EPO, for lack of efficacious neuroprotective drugs and relative safety of EPO (which has already been applied to anemia therapy in clinical practices for a long time).Therefore, we will explore the impact and mechanism of effects of delayed administration of mutant EPO, which has been newly developed with enhanced neuroprotective effects and without erythropoietic activity,on angiogenesis and neurogenesis in different stages after aged mice cerebral ischemia-reperfusion (especially in convalescence and rehabilitation period).This research will provide a reliable basis for clinical trials of mutant EPO.

促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）对脑缺血保护作用仍然是目前研究热点。本项目组一直致力于研究如何避免EPO副作用，最大限度行使EPO神经保护作用。前两个国自然面上项目分别从穿透血管脑屏障及大脑中动脉直接给药两个方面进行了相关研究。其他学者以及我们的研究结果发现仍然存在的问题：①动物多数集中在急性期研究，临床终点多是恢复期甚至康复期。②动物实验多是青壮年动物，且多数在缺血早期用药，与临床差异较大。③我们前期跨血脑屏障融合蛋白以及大脑中血管直接给药和其他学者EPO衍生物及给药方式的研究均存在局限性。EPO相对安全性（早已应用于贫血治疗）及现今缺乏有效神经保护药物使我们继续进行EPO的保护作用研究。本项目应用老龄小鼠研究延迟应用一种新的去除红细胞生成作用的变构EPO(mEPO)对脑缺血再灌注不同时期（尤其康复期）的血管神经新生修复作用及机制，为mEPO临床转化提供可靠依据。

促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）的神经保护功能也被大量基础及临床试验证实，但是其促进红细胞生成的作用限制了其作为脑缺血治疗药物的临床应用。我们前期通过突变一个氨基酸位点将人工重组EPO构建成为新型变构EPO（Mutant Erythropoietin, MEPO），使其丧失与EPOR二聚体结合的能力，但仍保留神经保护功能。本项目继续验证MEPO对不同年龄脑缺血小鼠的神经新生及血管新生作用。我们首先在青年（2月龄）和中年（8月龄）小鼠脑缺血模型，验证了MEPO在小鼠脑缺血后恢复期可以促进神经元前体细胞及神经元新生，还可以促进缺血区周边血管新生。此外，我们的结果显示MEPO可以抑制小鼠脑缺血后梗死周边区星形胶质细胞和小胶质细胞增值，这可以减轻脑组织恢复期疤痕组织的过度增生及长期的炎症反应，从而进一步促进神经新生及血管新生。我们检测发现，与模型组相比，MEPO处理组的脑组织中Wnt5a、EphB4/EphrinB2、CD200、CD200R4、SDF-1α信号通路明显激活，提示这些通路可能是MEPO发挥促进神经、血管新生的潜在机制。在此基础上，我们进一步通过中年（10月龄）雌性小鼠和老年（26月龄）雌性小鼠验证了MEPO可以在脑缺血后发挥脑组织保护作用。少突胶质细胞新生对脑缺血后白质修复至关重要，我们发现MEPO可以调节脑缺血后小胶质细胞表型从M1向M2型转化，从而促进少突胶质细胞新生，进而促进脑缺血后的白质修复，最终改善小鼠的神经功能。可能的机制是MEPO可以激活JAK2/STAT3通路表达，这个是小胶质细胞表型变化的分子开关之一，维持M2型小胶质细胞的表达。值得注意的是，在以上的所有研究中，MEPO发挥的作用于EPO相似，均无显著性差异，表明点突变没有影响EPO的组织保护作用。体外研究显示，MEPO可以促进氧糖剥夺处理的小鼠原代神经元干细胞增值的同时抑制其凋亡，并且MEPO可能通过IL-3、IL-5、GM-CSF的共同受体β亚基（β common receptor，βCR）发挥作用。综上所述，我们的研究证实了这种没有促进红细胞生成的MEPO具有促进神经血管新生的作用，为其作为一种潜在的缺血性脑血管病治疗药物的临床转化提供了科学依据。