miR-23a/27a/24-2簇细胞特异性调控元件在牛胎儿骨骼肌发育中的表观调控机制

Early development in bovine fetal stage has crucial effects on post-natal performance of beef muscle and intramuscular fat. However, these traits have a negative genetic correlation. miR-23a/27a/24-2 cluster is transcribed as a single precursor and processed into three members which can promote myogenesis but inhibit adipogenesis. However, little research on the transcriptional regulation of this cluster in specific cell type was reported. Applicant has proved miR-23a regulate early development of fetal bovine intramuscular fat. This study will focus on this miRNA cluster and fetal skeletal muscle derived stem cells will be used as the material. The research includes the chromatin activity and histone modification of cluster upstream sequence in myogenesis and adipogenesis, prediction and identification of transcription factors binding sites, long range regulatory mechanism of elements. Using genome editing technology, the elements will be mutated and its effects on cluster transcription, both in vitro and in vivo biology function will be evaluated. The research above will reveal the skeletal muscle or adipose cell-specific elements and their regulatory mechanism on the upstream of miR-23a/27a/24-2 cluster. This will provide theoretical foundation for breeding beef cattle with both growth rate and intramuscular fat.

牛胎儿期骨骼肌的早期发育，对后天肌肉发育和肌内脂肪沉积性状有重要的影响，但二者存在遗传负相关。目前对miR-23a/27a/24-2簇三个成员共同转录，剪切形成成熟体后促进肌肉分化、抑制脂肪分化有了初步认识，但对该miRNA簇在特定细胞类型分化中的转录调控研究较少。申请人前期研究证实miR-23a与牛胎儿早期肌内脂肪分化相关，因此，本研究拟以该miRNA簇为对象，以牛胎儿骨骼肌来源干细胞为材料，研究其在成肌/成脂分化过程中的染色质活跃性和组蛋白修饰特征，预测并鉴定骨骼肌或脂肪分化相关的转录因子结合位点，以及调控元件可能的长距调控模式；研究调控元件突变后对转录和生物学功能的影响，并构建元件突变动物模型研究其对活体骨骼肌和脂肪发育的影响。通过以上研究，确定miR-23a/27a/24-2簇上游的骨骼肌或脂肪“细胞特异性”调控元件的调控机理，为培育生长发育快且肌内脂肪丰富的肉牛品种提供理论基础。

牛胎儿期骨骼肌的早期发育，对后天肌肉发育和肌内脂肪沉积性状有重要的影响，但二者存在遗传负相关。目前对miR-23a/27a/24-2簇三个成员共同转录，剪切形成成熟体后促进肌肉分化、抑制脂肪分化有了初步认识，但对该miRNA簇在特定细胞类型分化中的转录调控研究较少。鉴于上述科学问题，本项目主要开展了以下研究内容：（1）采用Ⅳ型胶原酶消化方法过程中，采用CD140a为表面标记进行成肌细胞和前体脂肪细胞的分离纯化，对牛胎儿骨骼肌来源成肌细胞和前体脂肪细胞分离方法进行优化。本研究建立了一种分离牛胎儿骨骼肌来源前体脂肪细胞和成肌细胞的优化方法，为开展牛体外骨骼肌和脂肪诱导分化研究提供了一种有效的技术手段。(2) miR-23a在成肌分化中表达量上调，并且过表达miR-23a显著促进成肌分化，荧光素酶报告分析显示miR-23a可以直接靶向MDFIC，干扰MDFIC后促进成肌分化，过表达MDFIC后会抑制成肌分化。另外，MDFIC的作用可能是通过MyoG转录因子和MEF2C启动子之间的相互作用引起的。(3)miR-24-3p促进成肌分化，在成肌分化过程中miR-24-3p的表达量逐渐增加，过表达miR-24-3p显著促进成肌分化但抑制增殖。双荧光素酶报告分析显示，ACVR1B是miR-24-3p的靶基因。同时，敲低ACVR1B会抑制增殖促进分化。（4）利用RACE技术，分别扩增得到牛pre-miR-23a/27a/24-2的5’末端和3’末端，拼接后得到全长序列。根据得到的全长序列，分别构建了过表达和敲低的腺病毒载体。（5）构建了成肌细胞增殖期、分化0天、2天和4天的ATAC-seq数据，研究分析出前20个结合在染色质开放区域的转录因子可能参与了成肌分化过程。（6）根据NCBI数据库，比对RACE获得的全长序列，得到启动子序列。同时结合ATAC-seq结果，确定长距离调控元件区域。克隆获得启动子序列及长距离调控元件。双荧光素酶报告试验表明，启动子区具有调控转录活性功能。逐渐增加长距离调控元件时发现，距离启动子最近的P1活性最强。