适配体定向掩盖β-乳球蛋白致敏位点的脱敏行为及机理研究

Food allergy is a food safety issue of concern, seriously affecting the quality of food and people’s life. Reducing and controlling the allergenicity of food allergens to guarantee the health and safety of eaters has attracted more and more attention. Aptamer is a short single-stranded DNA or RNA sequence, isolated by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Aptamer has excellent affinity and specificity toward their targets and can regulate their bioactivity. Therefore, in this study, aptamers targeted to beta- lactoglobulin in cow’s milk will be selected. Then, the performance of the complex of aptamer and beta-lactoglobulin for allergenicity reduction will be determined by using the calculation of half inhibition rate IC50. The mechanism of reducing beta-lactoglobulin allergenicity by aptamer will be studied according to the analysis of the relationship between aptamer and beta-lactoglobulin binding structure and epitopes of beta-lactoglobulin. The effect of allergenicity reduction on the function of beta-lactoglobulin will also be investigated. Moreover, the cell models and animal models will be established to evaluate the effectiveness of allergenicity reduction by the detection of pre-composed and new-composed mediator in sensitized cell and mice. This research will provide theoretical basis and guidance for the application of aptamer technique for allergenicity reduction.

食物过敏是一个备受关注的食品安全问题，严重影响了人们的生活质量和食物品质。因此寻找有效途径来降低和控制食物过敏原的致敏性，从而保障消费者的健康和安全成为研究热点。适配体是经体外指数富集的配体进化技术筛选得到的一类寡核苷酸单链，能与靶标高亲和力高特异性结合，从而能够调控靶标的生物活性及功能。因此本项目以牛乳中主要过敏原—β-乳球蛋白为分析物，筛选得到特异性识别β-乳球蛋白的适配体库，以适配体结合β-乳球蛋白后的复合物为模型，结合半抑制率IC50值化学计算，筛选出具有脱敏性能的适配体序列；分析二者相互作用结构与过敏原表位结构的关系，阐明适配体对β-乳球蛋白的脱敏机理，以及脱敏行为对β-乳球蛋白自身功能的影响；建立细胞/动物模型，通过测定致敏激发后细胞/小鼠体内预合成的介质和新合成的介质水平，综合评价适配体对β-乳球蛋白脱敏效果。本研究将为适配体技术在食品致敏性控制中的应用提供理论依据和指导。

近年来随着牛乳制品消费量的不断增加，牛乳过敏在全世界内呈逐年增高趋势，严重影响了人们的生活质量和食物品质。为寻求一种安全有效的降低牛乳过敏的方法，保障牛乳过敏人群的安全消费及全面的营养摄入，本课题针对牛乳中最主要的过敏原—β-乳球蛋白开展了适配体定向掩盖β-乳球蛋白致敏位点的脱敏行为及机理研究。首先通过Capture-SELEX技术筛选获得与β-乳球蛋白高亲和力的适配体Lg-18，其解离常数Kd为65.00±27.42 nM。将该适配体结合表面增强拉曼技术和荧光光谱技术构建了高灵敏检测β-乳球蛋白的方法，检出限达0.05 ng/mL，证实所筛选适配体能够特异性识别靶标。接着在分子对接结果的指导下对适配体结构进行优化，证明环化适配体较之原始序列具有更好的亲和力（Kd=5.1±1.2 nM）和稳定性。经改良间接ELISA法检验，环化适配体结合β-乳球蛋白复合物的IC50值最大，说明适配体与β-乳球蛋白的结合降低其与IgE 结合能力。通过解析β-乳球蛋白晶体结构、过敏原表位结构和适配体三维结构，适配体能够在覆盖β-乳球蛋白过敏原表位氨基酸AA41-60，AA149-162区域，证明适配体在β-乳球蛋白表面上的结合位点与过敏原表位存在共定位现象，适配体结合β-乳球蛋白后可遮蔽其致敏位点。进一步构建细胞/动物模型，通过细胞免疫组化分析，证明适配体可与β-乳球蛋白结合并有效抑制β-氨基已糖苷酶、组胺、IL-4、IL-6和TNF-α的释放水平；动物免疫组化分析证明适配体可有效降低小鼠肠道通透性、血清中特异性抗体水平、炎症因子释放水平、体内脱颗粒水平，证明适配体可定向掩盖β-乳球蛋白致敏位点从而降低牛乳过敏原的致敏性。此外，基于本项目中构建的Capture-SELEX筛选平台，筛选获得了生物胺、呕吐毒素、金刚烷胺等食品危害物的适配体，并基于筛选获得的适配体结合可视化、荧光、表面增强拉曼光谱技术实现对上述危害物的高灵敏检测。本项目研究成果为控制β-乳球蛋白致敏性提供了一种新途径，为β-乳球蛋白在乳品工业中的应用提供理论和实验依据。