StpA调控自然感受态大肠杆菌中CRISPR/Cas系统的机制研究

Bacteria are able to take up exogenous DNA to increase its adaptability. Meanwhile, they face the risk of exogenous DNA invasion. The activation of the CRISPR/Cas system can selectively recognize and degrade the invasive DNA. In exponentially growing Escherichia coli, the nucleoid-associated protein H-NS regulates the CRISPR/Cas system. But the role of its homologue StpA remains undiscovered in the regulation of the CRISPR/Cas system. In previous work, the applicant revealed that stationary phase E. coli is able to establish natural competence for the uptake of the exogenous plasmid DNA, and discovered that StpA regulates the expression of the CRISPR/Cas system in naturally competent E. coli, implicating the presence of a new mode of regulation of the CRISPR/Cas system during plasmid uptake. However, the regulation mechanism of the CRISPR/Cas system remains unclear under such conditions. Based on the self-established transformation system, the applicant plans to uncover how StpA regulates the CRISPR/Cas system and the involved regulation network, providing a foundation for understanding how bacteria utilize the CRISPR/Cas system in defending against the invasion of extracellular DNA, and for extending the application scope of the CRISPR/Cas system in organism.

细菌可摄取外源DNA从而增强其适应性。同时，它也面临外源DNA入侵的风险。启动CRISPR/Cas系统可选择性地识别并降解入侵的DNA。对数期大肠杆菌中，拟核相关蛋白H-NS可调控CRISPR/Cas系统，但尚未发现其同源蛋白StpA具此功能。申请人前期研究揭示稳定期大肠杆菌可建立自然感受态，摄取外源质粒；发现StpA调控自然感受态大肠杆菌中CRISPR/Cas系统表达，提示质粒摄取时存在新的调控CRISPR/Cas系统的模式。但该条件下CRISPR/Cas系统调控机制尚不清楚。本项目中，申请人拟基于前期自行建立的大肠杆菌自然转化体系，构建检测CRISPR/Cas系统表达和功能的报告体系，揭示StpA调控CRISPR/Cas系统的机制及相关调控网络，为认识细菌利用CRISPR/Cas系统防御外源DNA入侵的机制奠定基础，为拓展CRISPR/Cas系统在生物体中应用范围提供依据。

虽然人们在CRISPR-Cas系统机制方面开展了深入的研究，但对其调控机制研究甚少。类组蛋白H-NS可与cas操纵子的启动子（Pcas）结合并抑制大肠杆菌I-E型CRISPR-Cas系统表达。虽然H-NS的同源蛋白StpA也能结合Pcas，但是它在调控CRISPR-Cas系统中的功能仍不清楚。本项目围绕StpA在调控CRISPR-Cas系统防御自然转化中的功能开展研究工作，揭示StpA与其同源蛋白H-NS发挥了相反的功能，它激活CRISPR-Cas系统防御大肠杆菌自然转化，主要证据如下：（1） 虽然hns缺失株中被激活的I-E型CRISPR-Cas系统干扰了CRISPR-Cas靶向plasmid转移，但是在该突变株中进一步失活stpA部分恢复了自然转化水平。（2）在hns突变株中失活stpA导致Pcas转录活性降低。（3）通过比较完整Pcas和H-NS结合位点突变的Pcas转录活性，表明StpA通过结合Pcas上H-NS的结合位点激活cas 基因转录。（4）通过阿拉伯糖诱导启动子表达StpA，表明低水平表达的StpA激活Pcas。（5）通过检测成熟CRISPR RNA的表达水平，表明StpA显著提高crRNA表达水平。（6）在hns和hns stpA双敲除株中诱导表达LeuO发现LeuO对Pcas的激活作用依赖StpA。（7）表明过表达小RNA对Pcas活性无明显影响。此外，本项目发现H-NS和StpA在调控大肠杆菌自然转化中的功能存在差异：前者显著抑制自然转化水平，后者对自然转化没有明显的影响。总之，本项目研究结果表明StpA在调控大肠杆菌I-E型CRISPR-Cas系统防御自然转化过程中扮演了转录激活因子的作用。本研究不仅拓展了关于CRISPR介导的适应性免疫防御外源核酸的认识，而且为理解CRISPR-Cas系统复杂的调控机制提供新的依据。此外，同源的类组蛋白StpA和H-NS通过结合相同的DNA结合位点发挥相反的功能，暗示类组蛋白可能通过折叠细菌染色体形成不同的高级结构转换原核生物的转录模式。