MLF1IP基因与真性红细胞增多症红系恶性增生的研究

The myeloproliferative neoplasms (MPNs) are a group of stem cell-derived clonal diseases in which cells of the myelo-erythroid lineage are overproduced. The discovery of JAK2V617F mutation is an important breakthrough in the understanding of BCR-ABL-negative MPN and several JAK2 inhibitors have been developed over recent years and are undergoing active clinical investigations. It remains unclear how this single mutation can associate with three different diseases. The myelodysplasia/myeloid leukemia factor 1-interacting protein(MLF1IP) gene is localized to human chromosome 4q35.1.In hematopoietic system, MLF1IP expression is confined mainly to the erythroid lineage，exclusively in CFU-E erythroid precursor cells. Polycythemia vera (PV) is a malignant disorder of hemaopoietic stem cells which is characterized by uncontrolled proliferation of red blood cells.We presumed that MLF1IP may play important role in the genesis of PV. Our primary data showed that MLF1IP mRNA levels were high in patients with MPN, especially in PV. In order to clarified the cooperativ pathogenetic contribution of MLF1IP gene with JAK2V617F on PV, the MLF1IP gene stable expression cell lines using MPN cell lines with JAK2V617F mutations and MLF1IP and JAK2V617 Knock-in mouse model will be established.This will be very important for understanding PV pathogenesis and develop new therapies, and also, more generally, to understand the stepwise mechanisms leading to cancer development in humans.

骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一组以一系或多系髓系细胞增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病,JAK2 V617F突变的发现以及JAK2抑制剂的问世开创了MPN研究新时代，但为何同一种突变会引起不同的疾病表型目前尚未明了。MLF1IP基因位于染色体4q35.1，其编码蛋白在造血系统主要表达于红细胞系统，并只表达于CFU-E阶段。真性红细胞增多症（PV）是一种红细胞不受控制的增殖为特征的造血干细胞疾病，因此，我们推测MLF1IP可能参与了PV的发生，预实验结果发现MLF1IP高表达于PV患者。本课题是在我们这一原创性发现的基础上得以提出，拟通过构建稳定表达MLF1IP的JAK2V617F不同表型细胞系和MLF1IP和JAK2V617F Knock-in 小鼠，从体内、外系统研究MLF1IP基因通过何种机制协同JAK2V617F导致PV发生，为下一步该病的治疗寻找新的分子靶标。

人MLF1IP基因位于染色体4q35.1，其编码的蛋白具有多个经典的结构功能域。既往研究证实MLF1IP参与了有丝分裂中着丝粒的组装，并通过募集相关蛋白等方式参与有丝分裂周期的调控。其同源基因在小鼠造血系统中被证实特异性高表达于早期的红系造血细胞，在CFU-GM和成熟B细胞中低表达，其他血细胞则几乎无表达，高度提示MLF1IP表达可能为红系特异性。真性红细胞增多症（PV）是一类红系造血细胞异常增殖、外周血细胞成熟相对正常的造血干细胞肿瘤。由于MLF1IP表达具有红系特异性且对有丝分裂产生重要影响，因此我们推测，MLF1IP可能凭借其特异性的表达模式与生物学功能参与了PV发生。基于以上各点我们设计了本课题，旨在探索MLF1IP 在PV 疾病发生中的作用及分子机制。本研究主要结果如下：1. 应用绝对定量PCR的方法检测正常供者骨髓细胞体外培养的红系和粒系集落形成单位以及PV，ET，PMF，MDS，AML患者骨髓单个核细胞（BMNC）中MLF1IP的mRNA水平，我们发现MLF1IP在人类造血系统中的表达呈现红系特异性，且在PV患者的早期红系造血细胞中表达增高尤为显著。2.设计针对MLF1IP基因mRNA序列的RNA干扰序列,以慢病毒载体为基础构建感染体系，获得稳定敲减MLF1IP基因的K562细胞株。MLF1IP通过上调cyclin D1、cyclin D2、CDK4、CKD6以及下调p21、p27加快细胞周期进程，增加处于活跃期的细胞数，进而对细胞增殖起到促进作用。3. MLF1IP转基因小鼠模型呈现出PV疾病的部分特征，例如Hb、HCT增高，EPO减低，红系集落增多等，但缺乏脾大、典型PV骨髓病理改变以及内源性红系集落（EEC）形成等重要特征。进一步分析结果显示MLF1IP转基因小鼠通过上调cyclin D2以及下调p21、p27加快细胞周期促进早期红系细胞扩增，从而参与转基因鼠PV-like疾病模型的发生。综上，我们证实MLF1IP在人类造血系统中呈现红系特异性表达模式，并通过调控细胞周期从而促进红系细胞增殖；此外我们还在小鼠体内验证，MLF1IP通过降低细胞周期中的抑制效应，使进入活动性周期的红系祖细胞比例增加，促进了终末分化前早期红系前体细胞数量的扩增，从而参与PV疾病的发生。