丝光绿蝇蛆虫抗菌肽的分子结构与生物信息学研究

丝光绿蝇蛆虫的分泌物已经被本课题组证实对感染创面具有良好的抗菌作用。在已完成的自然基金项目中，我们发现丝光绿蝇幼虫分泌物有一种抗菌肽，并对其进行了有效纯化，获得了部分生物信息。但是目前关于丝光绿蝇蛆虫产生的抗菌肽的确切基因序列和氨基酸序列还是未知的，为了确定此种抗菌肽完整的基因和氨基酸序列，从而人工重组新型生物抗菌肽，以实现临床治疗感染创面过程中，将人工合成的抗菌肽同时应用于创面，配合活体蛆虫清创的目的。我们将在本课题中进行以下研究：（1）构建完整的丝光绿蝇蛆虫cDNA文库（2）进一步获得高度纯化的丝光绿蝇蛆虫抗菌肽，利用已经建立的抗菌肽活性鉴定方法对抗菌蛋白进行抗菌谱及效价评价（3）将与此抗菌肽具有一定同源性的已知抗菌肽（Dermicidin）碱基序列进行探针设计，用放射性同位素标记法筛选和克隆丝光绿蝇蛆虫的抗菌肽基因。本研究将为治疗严重感染创面开拓一个新途径。

目前关于丝光绿蝇蛆虫产生的抗菌肽的确切基因序列和氨基酸序列还是未知的，为了确定此种抗菌肽完整的基因和氨基酸序列，从而人工重组新型生物抗菌肽，以实现临床治疗感染创面过程中，将人工合成的抗菌肽同时应用于创面，配合活体蛆虫清创的目的。该课题获得以下研究结果：1.明确了蝇种从产卵到化蛹到成虫的整个繁殖规律，摸索出更为科学可行的室内繁殖饲养的条件与方法，使其稳定传代并保持个体性状不发生大的改变；研究出科学安全的无菌蛆虫制备与保存技术，利于以后开展的分子生物学和临床研究。解决了在不同季节环境下，均能提供实验所需的数量稳定而充足的蛆虫问题；2. 通过预实验获得高度纯化的丝光绿蝇蛆虫抗菌肽，并将纯化得到的较小分子量的蛋白的电泳带进行质谱分析。根据蛋白质的分子量和质谱鉴定的结果（包括鉴定的肽段的数量、氨基酸序列的覆盖率和蛋白质鉴定的分值）分析，纯化得到的抗菌肽最有可能是与Macaca mulatta（一种已经知道结构的抗菌肽）有同源性的活性物质。但发现预实验结果不可重复，而且纯化的抗菌肽不能作为下一步实验的基础，因此改变实验思路，将具有抗菌活性的蛆虫血淋巴通过Tricine胶分离后，经过质谱检测及NCBI搜索结果比对显示分离得到的肽段可能为porin等多种蛋白，其中porin很有可能是丝光绿蝇血淋巴中的有效抗菌成分(抗菌肽)，根据鉴定的肽段合成不同的简并引物，通过PCR的方法验证从丝光绿蝇血淋巴中克隆出porin蛋白；3. 该课题没有建立完整的丝光绿蝇蛆虫cDNA文库并根据已知丝光绿蝇蛆虫分泌物的抗菌蛋白同源性抗菌肽类物质Dermcidin的氨基酸序列(功能保守区域), 设计和优化相应核苷酸探针筛选目的基因；用放射性同位素标记法筛选和克隆丝光绿蝇的抗菌肽基因；并与已知抗菌肽进行同源性比较分析。该课题目前仍在继续研究，在已完成的进行获得高度纯化的丝光绿蝇蛆虫抗菌肽的过程中，由于氨基酸简并性的关系，所以根据蛋白质设计cDNA的引物有其复杂性，故必须通过大量设计引物才能确定质谱鉴定所得肽段是否在丝光绿蝇幼虫体内存在。我们在该课题执行中，根据质谱鉴定的porin序列设计简并引物，再提取蛆体血淋巴RNA、通过RT-PCR实验，成果克隆出质谱鉴定的porin，其氨基酸序列的测序结果与家蝇defensin存在较多一致的位点。 该课题仍处于探索性阶段，需要进一步的数据支持。