体内Pig-a基因突变试验方法优化与分子机制研究

In recent years, in vivo gene mutation assay based on the Pig-a gene locus has drawn the attention of academics by its advantages of high-throughput, high-sensitivity, labor-saving and wide mutation spectrum. The purposes of this subject include: to establish and optimize the Pig-a gene mutation assay based on flow cytometry and limiting-dilution cloning, to establish feasible operation standards and evaluation procedures after the method validation, to explore the spectrum mutation of this assay. Moreover, to establish a 28-day rats test platform integrating both repeat dose general toxicity study and mutagenicity test. A set of standard substances will be evaluated by this platform for exploring their dose-response relationship and the “no observed genotoxic effect level”, meanwhile, to evaluate the accuracy, sensitivity and practical value of the system..This subject would lay the foundation for the further generalizing of Pig-a gene mutation assay. There would be a promising prospect for application of the comprehensive system which combines general toxicity study and mutagenicity test. The implementation of this subject would narrow gaps between domestic and advanced international level in assessments of genotoxicity, and highly promote the domestic level of chemicalsafety evaluation and risk assessment.

Pig-a基因突变试验是近年来新发展起来的体内遗传毒性试验，因其具有高通量、高灵敏度、省时省力、可检测致突变谱较广等优点，已引起学术界的关注。本课题拟建立并优化体内Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法，对其进行方法学验证；建立和优化有限稀释法检测方案，制定实用、可推广的评价程序和检验方法规范，并探索试验可检测的突变谱和分子机制。在此基础上，建立大鼠28日重复剂量遗传毒性+一般毒性综合评价体系，使用该体系对成组标准物质进行检测，阐明其量-效关系和时-效关系，确定“未观察到遗传毒性的最大剂量”阈值，评估该体系的准确度、灵敏度和实用价值。.本课题可为体内Pig-a基因突变试验的推广应用奠定基础，拟建立的重复剂量遗传毒性+一般毒性综合评估体系也应具有较大的实用价值。本课题的完成将缩小我国在遗传毒性评价领域与国际先进水平的差距，对于提升我国的化学物安全性评价和风险评估水平有重要作用。

近年来，ICH、IWGT等国际组织均建议将毒性试验整合以实现3R原则、提高检测效率。Pig-a基因突变试验是新发展起来的体内遗传毒性试验，因其具有高通量、高灵敏度、取样简便、可检测致突变谱较广等优点，受到了学术界的广泛关注。.基于上述背景，本课题首先建立了Pig-a基因突变试验（流式细胞术方法和有限稀释法）；根据FDA和ICH指南对流式细胞术方法的方案性能进行了验证，结果显示试验方案具有较好的线性、特异性、灵敏度和精确度；并制定了标准操作程序。继而建立了大鼠外周血和骨髓流式微核流式细胞术试验方案，并使用一系列标准物质对试验性能进行了验证；结果显示所建方法结果稳定、背景微核率较低、灵敏度高，与人工计数方法检测结果具有很好的一致性。基于上述方法，课题建立了高涵盖面的大鼠体内遗传毒性整合体系和遗传毒性+一般毒性综合评价体系，使用一系列标准物质对综合评价体系进行了验证，并进一步将所建体系应用于丙烯酸异辛酯、亚硒酸钠、丁香酚、2-甲基呋喃、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1的遗传毒性和一般毒性评价，同时使用定量遗传毒性评估方法计算了遗传毒性阳性物质的遗传毒性阈值并评估了其毒作用模式。.课题建立的Pig-a基因突变试验、流式微核试验具有操作简便快捷、成本较低的优点，有较大的应用价值，可为评估食品、药品和其他化学品的安全性提供一种实用和可靠的检测方法。所建立的大鼠重复剂量染毒遗传毒性+一般毒性试验综合评价体系提高了检测效率、降低了检测成本，具有一定的社会效益和经济效益。课题中所探讨和使用的定量遗传毒性评估方法是遗传毒理学的发展方向，在化学物遗传毒性评价和人类致癌性风险评估中具有重要的应用价值。本课题的完成缩小了我国在遗传毒性评价领域与国际先进水平的差距，对于提升我国的化学物安全性评价和风险评估水平有重要作用。