Tf-PEG-IGFBP7-saRNA靶向性纳米粒RNA激活诱导转移恶性黑素瘤凋亡研究

恶性黑素瘤(MM)患者生存率低，遏制转移性MM成亟待解决问题；我们证实IGFBP7 是诱导MM凋亡理想靶点。本研究采用靶向纳米载体技术构建表面含转铁绿色荧光蛋白其内携带小激活RNA的Tf-PEG-IGFBP7-saRNA纳米粒。运用表面等离子共振、激光共聚焦、电镜、粒径电位仪、电泳等测定纳米粒与MM胞膜外转铁蛋白受体（TfR）结合力、理化表征、载药率；通过细胞侵袭、划痕实验、免疫印迹、流式细胞术等测定其对MM侵袭、迁移及IGFBP7表达、凋亡的影响。经体内生物相容性、毒性测定后最终实施诱导鼠转移MM凋亡研究，使纳米粒通过血液循环至MM转移灶经TfR内吞导入IGFBP7-saRNA反义核酸，以RNA激活技术促IGFBP7高表达来诱导MM凋亡实现生物靶向治疗。该技术避免了传统化疗毒性大、以病毒作为基因治疗载体存在免疫原性强，潜在危险性等问题，有望成为特异性高、靶向好、副作用少MM基因治疗试剂。

本课题按计划进行IGFBP7-saRNA设计与筛选。但因设计及saRNA转染效率欠理想，改用了慢病毒过表达系统。以人igfbp7基因序列为模版合成编码序列，通过内切酶酶切、连接酶连接，将igfbp7插入LV5-GFP，成功构建靶向IGFBP7的慢病毒表达载体。筛选阳性克隆后与包装质粒通过脂质体共转染SK-MEL-28黑素瘤（MM）株。采用荧光显微镜观察SK-MEL-28感染病毒的效率，Realtime PCR检测igfbp7mRNA表达，流式细胞术检测细胞凋亡率。研究发现靶向病毒载体的细胞感染率在80%左右，Realtime PCR检测表明处理组igfbp7mRNA表达高于对照组（p<0.05），但对照组及处理组凋亡率差异无统计学意义。提示人的MM细胞系可能与鼠的存在差异，IGFBP7靶点可能不适合治疗人MM。寻找有效遏制MM靶点成突破课题瓶颈关键。我们对人MM标本进行了基因芯片及生物信息学分析，研究发现了PCDH9、Sema3c、RASAL2、ERBB3等192个基因与人MM的预后密切相关。此外课题组亦发现Rac1在皮肤恶性肿瘤形成及转移中充当重要角色，提示抑制Rac1可能是遏制MM的理想靶点。我们在课题中也尝试采用白藜芦醇遏制MM获得成功, 白藜芦醇可抑制MM细胞株A375、SK-MEL-31的增殖，其机制可能与细胞G1期阻滞、S期细胞减少有关。白藜芦醇可诱导A375、SK-MEL-31细胞凋亡，还可能与上调促凋亡蛋白P53、Bax/Bcl-2、Caspase-9/Caspase-3的表达有关。上述研究成果已发表3篇SCI论著、另1篇中文论著已被录用待刊。在靶向纳米粒方面我们利用脂质体通用的反向蒸发法制备GSH响应性磁性PEI-SS-十八胺纳米微球，并偶联转铁蛋白构建了靶向-谷胱甘肽响应-顺磁性纳米粒并采用粒径及Zeta电位分析、TEM观察纳米粒子表面及其理化性质、离心法琼脂糖凝胶电泳检测纳米材料的DNA包封率及的释放率，MTT检测不同浓度纳米粒对肿瘤细胞存活率的影响。靶向纳米材料的粒径及DNA结合率及释放率符合预期且纳米对细胞的毒性低，证明成功制备纳米材料。因PCDH9为抑癌基因，目前学者已证实Rac1与MM转移侵袭有关。本课题组拟后续研究“PCDH9对Rac1调控在MM侵袭及转移中的作用”，并探讨靶向纳米粒上调PCDH9遏制MM转移的可行性。.