蛋白Y3对烟草花叶病毒的抑制机理研究

Y3 is a novel protein purified by applicants from Coprinus comatus ,and it has the inhibitory activity against Tobacco mosaic virus .With unique properties such as small molecular weight, high stability in vitro, it has great potential in the development of biological pesticides and antiviral gene breeding. but it is lack of the deep study on the antiviral mechanism.In this project three aspects will be studied on the mechanism of Y3 against TMV :( 1 ) we will determine whether the Y3 interacting with CP, and if yes, the interaction sites will be determined; ( 2 ) we will identify whether Y3 is a kind of RIP, and if yes, we will determine the relationship between anti-TMV activity and RIP activity; (3 )we will study whether protein can induce plant system resistant to virus. Based on the above experimental results, a comprehensive view on the mechanism of Y3 against TMV will be provided. All of the results will not only clarify the interaction between Y3, plant and TMV, reveal the laws of nature, but also provide a theoretical basis for the development of biological pesticides of Y3 and for transgenic breeding, and provide a reference for other similar antiviral protein research. In practice, it can provide high quality new gene resources for tobacco breeding, the prokaryotic expression system with high expression ability obtained in the experiment will be the foundation of developing biological pesticide with independent intellectual property rights.

Y3是申请人从毛头鬼伞中提纯的一种对烟草花叶病毒具有抑制活性的新蛋白，具有独特的性质如分子量小，体外稳定性高等，在生物农药开发和抗病毒基因育种中应用潜力巨大，但目前对其抗病毒机制缺乏深入研究。本项目将从三个方面对Y3的抗TMV机制进行探讨（1）确定Y3能否与CP互作，并确定其互作位点；（2）鉴定Y3是否为一种RIP，并确定其抗TMV活性与RIP活性之间的关系，（3）研究蛋白能否诱导植物对病毒产生系统抗性。综合以上实验结果将就Y3对TMV的抑制机理提出较全面的观点，这不仅在理论上有望阐明Y3与植物、TMV三者之间的互作关系，揭示自然规律，为转基因育种和Y3蛋白作为生物农药开发提供理论依据,并为其他类似抗植物病毒蛋白的研究提供借鉴。在实践中则可为烟草抗病育种提供优质的新基因资源，在实验中获得的高效表达Y3蛋白的原核表达系统则为创制出具有自主知识产权的生物农药及商品化生产Y3奠定物质基础。

利用生物活性物质抑制病毒是农业上防治植物病毒病害的策略之一。Y3是项目负责人从毛头鬼伞中提纯的一种对烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）具有抑制活性的新蛋白，具有独特的性质如分子量小，体外稳定性高等，在生物农药开发和抗病毒基因育种中应用潜力巨大，本项目就蛋白的抗性机理进行了一系列的研究，结果如下：（1）利用酵母双杂交系统和双分子荧光载体确定Y3能与TMV外壳蛋白（CP）在活体内外互作，定点突变位点对其互作没有影响。（2）构建了Y3蛋白及突变体的原核表达系统，在IPTG终浓度1mmol/L、温度37℃、转速200r条件下，表达量最高，利用镍柱对诱导表达后的菌体上清进行纯化，蛋白Y3在咪唑浓度为200mM时达到最高洗脱峰，突变体Y3 T1在咪唑浓度为100、200mM时均得到较好的纯化。经纯化后证实能抑制TMV。（3）利用真核表达纯化产物进行了Y3对烟草花叶病毒的抗性机理研究，结果表明Y3蛋白会诱导PAL及PPO酶活性升高，对β-1,3葡聚糖酶活性有很小的诱导作用，而在一天内即可诱导POD酶活升高。荧光定量PCR显示Y3对PR1-a基因的表达量诱导升高作用不明显，但能在不同程度上诱导PR1-b、NPR1、PAL基因表达量升高。综上不仅就Y3对TMV的抑制机理提出较全面的观点，那就是Y3既能通过与TMV CP互作直接抑制病毒在植物体内的增殖，也能系统性的诱导植物的抗病毒活性。而且项目组还获得了具有抗病毒活性的Y3蛋白原核和真核表达系统。这在理论上阐明了Y3与植物、TMV三者之间的互作关系，为转基因育种和Y3蛋白作为生物农药开发提供理论依据,并为其他类似抗植物病毒蛋白的研究提供借鉴。在实践中则为烟草抗病育种提供了优质的新基因资源，高效表达Y3活性蛋白的原核和真核表达系统则为创制出具有自主知识产权的生物农药及商品化生产Y3奠定了物质基础。