TBK1介导的固有免疫识别通路在葡萄膜炎发生发展中的功能与机制

Uveitis is a worldwide leading cause of vision impairment and blindness. However, the efficiency of current therapy is limited and often arises serious side effect, it thereby requires urgently an effective and specific medicine. It has documented that innate immune through Toll-like receptor signaling played a crucial role in the development of uveitis via the regulation of autoimmune response. While the TBK1-mediated signaling of cytosolic nucleic acid sensing by RIG-I-like receptors and cGAS is a fast-developed research area in recent years, its function and mechanism in uveitis is largely unexplored. On the other hand, we have developed a uveitis model based on zebrafish and established a few knockout lines for key components of TBK1 signaling pathway, which provides us advantages over conventional uveitis model on rat and set us a strong basis for proposed study. By combination of mammalian primary/cultured cells and zebrafish model, we plan to define the key role of TBK1 mediated cytosolic nucleic acid sensing and uncover the mechanism in uveitis development. Besides, we will establish a high-throughput screening for chemical compounds on zebrafish model, to seek the lead compounds for the potential cure of uveitis. Therefore, the proposed study will not only unravel the complex mechanism for uveitis development, but might also benefit directly to our eye health.

葡萄膜炎是主要致盲性眼病之一，目前所用药物不良反应较多，亟需探索新的眼特异的抗炎制剂。已有证据表明Toll样受体固有免疫通路通过调节机体自身免疫在葡萄膜炎的发生发展中发挥重要作用，但TBK1介导的固有免疫识别通路在葡萄膜炎中的作用与机制尚未明确。TBK1通路在识别外源或细胞自身泄漏的核酸等信号后，能够强烈激活机体的固有免疫反应，生成多种促炎因子与抗炎因子并调节免疫细胞的分化与功能。同时，为拓展葡萄膜炎的研究工具，充分利用各种模型的优势，本项目前期已成功建立具有特色的脊椎动物斑马鱼葡萄膜炎模型，并已获得了数个相关基因敲除的斑马鱼鱼系。在此基础上，拟进一步探索TBK1介导的固有免疫识别通路在葡萄膜炎发生发展中的功能和作用机制，并开发可用于高通量药物筛选的斑马鱼葡萄膜炎模型。本研究具有重要的生物学意义和潜在的临床转化价值，对进一步明确葡萄膜炎的发病机制及筛选潜在的特异性药物都具有重要的价值。

葡萄膜炎是重要致盲性眼病，其发病机制尚未完全明确。本项目研究和探索了TBK1介导的固有免疫识别通路在葡萄膜炎发生发展中的作用与可能的机制。为明确TBK1在临床葡萄膜炎患者中的表达情况，我们通过qPCR和WB检测特发性全葡萄膜炎患者和正常人的外周血单个核细胞中TBK1 mRNA的表达水平和磷酸化蛋白水平，通过比较后发现这两个检测指标在葡萄膜炎组中的表达水平较正常人组升高。同时，我们检测到NF-κB p65的磷酸化蛋白水平在患者组中也同样上调。为进一步研究TBK1在葡萄膜炎中的功能和作用机制，我们建立了葡萄膜炎动物模型和免疫细胞炎症模型。在此基础上，我们检测了TBK1、TBK1磷酸化水平在葡萄膜炎动物模型的眼部组织和LPS诱导的免疫细胞炎症模型中表达均上调，提示TBK1与葡萄膜炎密切相关。同时，发现在葡萄膜炎动物模型中NF-κB p65的mRNA和磷酸化水平表达显著升高，同时通过免疫荧光法检测到其眼部组织中焦亡相关指标NLRP3和caspase-1的表达水平也相对升高，这些结果显示了NF-κB p65和焦亡在葡萄膜炎动物模型的眼部组织中处于被激活状态。而后进一步研究TBK1的作用机制，发现炎症诱导状态下与炎症诱导联合TBK1抑制情况下NF-κB p65的易位情况不同，TBK1抑制后易位比例明显下降。上述结果显示TBK1可能通过NF-κB p65信号通路调节炎症反应。另外，通过观察靶向TBK1抑制后葡萄膜炎动物模型眼部组织中炎症小体（NLRP3）和caspase-1激活的变化，以及不同浓度的NF-κB抑制对巨噬细胞caspase-1活性的影响，显示了抑制TBK1/NF-κB p65信号通路可能缓解焦亡。在研究过程中，本项目筛选出TBK1特异性抑制剂GSK8612，并验证了其对炎症反应的减轻作用，揭示了其可能是治疗葡萄膜炎的潜在的靶向药物。综上，本项目首次阐明TBK1在葡萄膜炎发生发展中的作用和分子机制，为葡萄膜炎的治疗提供了潜在的靶点和新思路。