禽冠状病毒IBV反向遗传株S基因定点突变、受体筛选与细胞适应

As one of the largest in RNA viruses, Infectious bronchitis virus (IBV) is a typical species of coronavirus. However, the mechanism of IBV vaccine strains (H120, M41) that isn't able to proliferate in passage cell is not understood. Aims to this objective, Based on constructed IBV reverse genetic system(R-H120, R-SAIBK and R-M41) (30972201),this research were done as follows: 1.For the purpose of verifying mutation sites of spike protein of IBV, reverse genetics technique is used to mutate several amino acid sites (38,43 etc.) of spike gene,and IBV strain that can cultured on cell were obtained.2.The yeast two-hybrid, co-immunoprecipitation and fluorescent confocal technologies are used to screen and verify IBV receptor, the verified receptor or receptor gene is transfected to passage cell to construct IBV adaptation cells. 3. By using subsection cloning technology, the receptor binding site will be verified in S protein, and some bioinformation analysis methods will be used to analyse the relationship between S protein and receptor in space structures. This research is expected to demonstrate IBV cellular adaptation mechanism, and it has critical scientific value and application prospect.

禽传染性支气管炎病毒（IBV）是冠状病毒的代表种，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒之一，但H120，M41等疫苗株不能够在传代细胞上生长，其机理尚不清楚，针对该科学问题，申请者在成功构建IBV反向遗传株（R-H120，R-SAIBK，R-M41）基础上(自然科学基金30972201)，拟开展以下三方面研究：1、用反向遗传操作技术对IBV纤突蛋白S（38，43等）关键氨基酸位点进行定点突变，验证、筛选适应细胞的IBV毒株。2、采用酵母双杂交、免疫共沉淀、荧光共聚焦等技术，筛选IBV的细胞受体，将受体转染传代细胞，获得IBV可生长的传代细胞株。3、分段克隆验证S蛋白与受体结合位点，用生物信息学分析S蛋白与受体空间结构，阐明IBV适应细胞的分子机理。本项目的实施，可获得IBV细胞适应株，探明IBV细胞适应性机理，具有重要的科学价值和应用前景。

在该项目资助下，课题组完成了以下研究工作：1、IBV与细胞适应性相关S蛋白氨基酸位点研究。利用反向遗传技术将具有细胞适应性的IBV Beaudette-P65株的S基因替换到H120、SAIBK及M41的基因组中，使拯救重组毒株具有感染传代细胞Vero和CK细胞的能力，证明S基因38、43、56、66、69、117、118及128等位点对IBV细胞适应具有重要作用。2、筛选与验证IBV细胞受体。通过酵母双杂交系统从鸡肾细胞cDNA文库中筛选与IBV S1蛋白相互作用的宿主蛋白，再通过回转验证、免疫共沉淀、共聚焦验证得到与IBV S1蛋白结合的蛋白HSP47。3、IBV与细胞适应性的分子构像关系研究。通过将S1基因分段表达的方式，确定S1蛋白与受体结合位点存在S1的N端260氨基酸内。再以确定的受体结合区进行亲和层析pull-down，结合质谱方法筛选到鸡组织中与S1作用的蛋白HSP90。对IBV毒株受体结合区蛋白及HSP47、HSP90的结构预测（phyre2）表明，IBV的受体结合区的125-230氨基酸内存在一个半乳糖结合位点的相似区域，125-230氨基酸在不同毒株间较为保守。而HSP47与HSP70蛋白结构预测结果可信度较高。4、鸡肾组织在不同肾型IBV毒株攻毒后转录组及小RNA组研究。通过转录组及小RNA组测序分析，预测出一些与病毒毒力、免疫反应等过程相关的基因和miRNA，为IBV进一步研究提供参考。5、IBV在鸡巨噬细胞系（HD11）内复制过程中细胞凋亡反应研究。建立了IBV复制的禽细胞模型（鸡巨噬细胞系HD11），并揭示Fas/Fas配体介导的信号传导途径和Bcl-2家族介导的信号通路与IBV感染引起的细胞凋亡相关。6、传代细胞适应毒株的获得及验证。细胞传代和免疫攻毒表明，构建的重组R-H120-BeaudetteP65S具有可以很好适应传代Vero细胞，并且具有与亲本毒株H120一致的免疫保护能力。7、项目执行期间，成功获得传代Vero细胞适应的重组IBV毒株R-H120-BeaudetteP65S，发表SCI 6篇，申请专利1项，全面完成项目要求的内容。