抗生素与猪肠道菌群DGGE指纹图谱多样性及宏基因组水平耐药基因谱相关性研究

由于抗生素广泛使用,猪肠道细菌的耐药性已非常严重。抗生素的使用与猪肠道菌群DGGE指纹图谱多样性及宏基因组水平耐药性基因谱相关性研究未见报道。本课题建立猪肠道菌群宏基因组DNA提取方法，以肠道菌群总DNA为模板，用PCR-DGGE技术，得到猪肠道细菌DGGE指纹图谱，分析用药与否与肠道细菌多样性的相关性。在宏基因组水平上，用多重PCR检测细菌DNA中对6大类药物(β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、氯霉素类) 的20种耐药基因，探明在用药与不用药情况下猪肠道内可培养菌与不可培养菌耐药基因谱的差异及变化规律。该研究可为猪肠道疾病防治、合理使用抗生素、保障猪肉产品安全提供科学支持。以猪为研究模型建立的研究方法和获得的结果可以为抗生素的使用对人及其他动物肠道菌多样性及耐药基因谱的相关性研究提供借鉴。

本课针对抗生素使用对猪肠道菌群及其耐药性的影响这一科学问题，完成了以下研究工作：1、建立猪肠道菌群多态性的宏基因组DNA提取方法。根据猪粪样的特点，对粪样预处理方法和细胞裂解缓冲液主要成分进行了改进创新，形成新的DNA提取方法，与四种常用提取方法进行比较，结果表明：新方法所提总DNA完整性、浓度、纯度、得率及扩增效果均较好；2、选用猪常用抗生素的代表药物：头孢噻呋钠（EFT）、丁胺卡那霉素（AK）、乳酸环丙沙星（CIP）给猪口服，分析在用药与不用药情况下猪肠道菌群的DGGE指纹图谱的差异：采用PCR-DGE方法分析猪口服EFT、AK、CIP前后三个时间点猪肠道菌群总DNA的16s rDNA V3区指纹图谱差异性，鉴定出了变化明显的9种优势菌群；3、EFT、AK、CIP给猪口服，采集投药前后16个时间点分离的猪肠道大肠杆菌，测定大肠杆菌的MIC值，结果表明：用药3天后大肠杆菌MIC值明显增高，停药25-30天后降低至用药前水平，为休药期提供依据。率先探明在用药与不用药情况下猪肠道菌群细菌耐药表型的动态变化规律；4、针对三种抗生素的耐药基因（EFT共6种，AK共16种，CIP共6种）分别设计特异性引物，用PCR扩增和测序，对用药前后16个时间点分离的大肠杆菌耐药基因进行检测，结果表明：投药后EFT组大肠杆菌SHV、MY-2和TEM-1基因检出率增加，停药后降低；AK组耐药基因检出率在用药前后无变化；CIP组大肠杆菌gyrA的83、87位点和parC的80位点发生突变。探明在用药与不用药情况下不同抗生素引起猪肠道菌群细菌耐药基因的变化情况；5、完成了EFT、AK、CIP口服前后猪肠道大肠杆菌耐药表型与耐药基因型的相关性研究。结果表明：SHV、MY-2和TEM-1基因是EFT投药组肠道大肠杆菌耐药性变化的主要原因；CIP投药组肠道大肠杆菌耐药性变化主要与gyrA的83、87位点和parC的80位点突变有关。.本研究探明了在用药与不用药情况下猪肠道菌群多样性的变化和在用药与不用药情况下猪肠道大肠杆菌耐药表型及基因的差异及变化规律，结果可为猪肠道细菌性疾病防治、合理使用抗生素和休药期、保障猪肉产品安全提供科学支持。以猪为研究模型建立的研究方法和获得的结果可以为人及其他动物在使用抗生素后肠道菌群多样性及耐药性研究提供借鉴。