Nogo-B对肺泡巨噬细胞功能的调控及其与慢性阻塞性肺疾病气道免疫防御的关联性研究

Based on the hypothesis that Nogo-B, a family member of reticulon protein family 4, plays an important role in modulating the function of alveolar macrophages (AM) and innate immune defense of lower respiratory tract in COPD, we designed the following research. In this study, first of all, we will examine the effects of Nogo-B on recognition, phagocytosis and immune response of AM separated from wild-type or Nogo-B knock-out C57BL/6 mice using Nogo-B adenovirus transfection in vitro. Then, a smoke-induced COPD mice model will be used to detect the expression change patterns of Nogo-B and to observe the effects of internal Nogo-B expression on the function of AM in COPD mice. Finally, non-typeable hemophilies influenzae will be instilled into the tracheas of COPD mice to mimic lower respiratory tract infection, and the severity of lung inflammatory response, survival time, survival rate and pulmonary bacterial planting will be measured to evaluate the possible role of Nogo-B in innate immune defense of lower respiratory tract in COPD mice. The present study will be of great help to understand the role of Nogo-B in modulation of AM function and innate immune defense in COPD and to provide a new strategy in prevention and treatment of COPD.

基于网状蛋白家族4成员中的Nogo-B对肺泡巨噬细胞（AM）生物学功能及慢阻肺下呼吸道固有免疫防御具有重要调控作用的假设，本研究首先拟以分离的小鼠AM为对象，采用基因敲除及重组腺病毒高表达等手段，观察通过调控Nogo-B表达对AM识别、吞噬、参与炎症反应等固有免疫相关功能的影响；在此基础上，复制慢阻肺小鼠模型，采用Realtime PCR、Western blot等方法，观察模型小鼠肺组织及AM Nogo-B表达的变化规律，同时探讨通过调控慢阻肺模型小鼠肺内内源性Nogo-B的表达对AM生物学功能的影响；最后，复制慢阻肺小鼠下呼吸道感染模型，观察不同Nogo-B表达水平组之间，小鼠下呼吸道的炎症程度、生存时间及生存率和肺组织细菌定植程度等指标间的变化。以期阐明Nogo-B对AM固有免疫相关功能的影响及其在慢阻肺气道固有免疫防御中的地位，为慢阻肺的防治拓展新的思路。

项目的背景.肺泡巨噬细胞（AM）功能减弱是慢阻肺患者易于并发下呼吸道感染的一个极其重要的因素。网状蛋白家族4成员Nogo-B的表达降低或缺失可抑制炎症环境下单核/巨噬细胞的伸展、趋化及炎症因子释放能力。Nogo-B的表达变化是否参与了慢阻肺病程中AM生物学功能的调控过程，目前尚不明确。.主要研究内容. 调控Nogo-B表达对AM固有免疫防御功能的影响；观察慢阻肺小鼠模型AM的Nogo-B表达变化规律及其对AM功能的影响；调控Nogo-B表达对慢阻肺小鼠气道免疫防御能力的影响.重要结果.1、在体及体外研究证实香烟烟雾可诱导AM的Nogo-B表达降低；2、Nogo-B通过调控TLR4在细胞膜的定位，调控了TLR4信号通路活性；3、Nogo-B的表达下调可抑制巨噬细胞释放PTX3等具有抗菌活性蛋白的表达水平；4、成功构建Nogo-B敲除C57BL/6小鼠；.关键数据及其科学意义.1、采用1%-20% CSE作用体外培养的RAW264.7细胞6，12，24后，10% CSE处理组约30%，20%组达60%。长期烟雾吸入复制的大鼠慢阻肺模型中，肺组织Nogo-B蛋白表达降低约3倍，肺泡灌洗液炎症细胞中Nogo-B蛋白表达降低约6.2倍，提示Nogo-B参与了香烟烟雾诱导的肺部炎症的发生、发展过程；.2、采用siRNA干扰下调RAW264.7细胞Nogo-B的表达水平后，细胞表面TLR4的表达密度降低，相应的其下游的关键信号分子P38MAPK、JNK、NF-kB、IRF3的磷酸化活性程度也随之降低，下游炎症因子IL1beta、MCP-1的表达也相应降低。采用腺病毒转染的方法高表达Nogo-B表达水平后，上述现象得以逆转。此外，下调Nogo-B表达还抑制了RAW264.7细胞MSR-1的表达，但对细胞的增殖、凋亡、迁移以及吞噬功能无明显影响。通过表达谱芯片筛查证实上调巨噬细胞Nogo-B的表达，还可以促进巨噬细胞在基础及感染状态下具有抗感染功能的PTX3的表达水平。这些结果提示，香烟烟雾诱导的Nogo-B表达下调可能主要通过抑制TLR4介导的炎症通路以及抑制抗感染蛋白PTX3的表达而削弱巨噬细胞在感染状态下的固有免疫防御功能，从而参与慢阻肺呼吸道感染的发病过程；.3、经反复传代饲养14代后，得到基因背景较纯净的C57BL/6 Nogo-B-/-小鼠。