HIV-1病毒脱壳实时成像及机制研究

HIV-1 uncoating is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Uncoating is a critical step of HIV-1 early infection but is poorly understood. There are several contradictory models for HIV-1 uncoating. Real-time imaging of HIV-1 uncoating will uncover the process reliably and directly in live cells. In this study, we will label the HIV-1 genomic RNA with [Ru(phen)2(dppz)]2+ and label HIV-1 capsid protein (CA) with the biarsenical-tetracysteine system. Then, using single-particle tracking and super-resolution microscopy, we will image the dynamic behaviors of HIV-1 genomic RNA and capsid and reveal the dynamic process and mechanism of HIV-1 uncoating in live HIV-infected cells in real-time. Based on the real-time imaging and the traditional biochemical analysis and verification, we will also explore the roles of cytoskeleton including microfilaments and microtubules, some important viral proteins such as matrix protein (MA) and integrase (IN), cellular protein TRIM5α,and other factors playing in HIV-1 uncoating. This study will reveal the dynamics and mechanism of HIV-1 uncoating. This study will also provide new methodology for the virus uncoating research and help to understand the uncoating processes of other viruses.

艾滋病毒HIV-1脱壳是指病毒衣壳的解离和释放核蛋白复合物的过程，为HIV-1侵染早期阶段的关键环节。目前对于HIV-1脱壳过程认识还很欠缺，所提出的几种解释模型相互矛盾。实时成像研究可真实、直观、动态、可视地解析这HIV-1脱壳这一重要过程。本申请拟利用金属钌配合物和双砷染料-四半胱氨酸体系分别标记HIV-1病毒的基因组RNA和衣壳蛋白CA，借助单病毒颗粒动态示踪和超分辨荧光成像，在病毒侵染的活细胞内实时、动态、超分辨地解析HIV-1病毒基因组RNA与衣壳的动态行为及脱壳发生的时间、位置及动态过程与机制等。结合实时动态成像和传统生化方法，研究细胞微丝微管及一些重要病毒蛋白包括基质蛋白MA和整合酶IN及细胞因子TRIM5α等在病毒脱壳过程中的作用，深入解析HIV-1脱壳过程及调控机制。本研究的开展，将实时动态可视化解析HIV-1脱壳过程与机制，同时也将为其它病毒脱壳提供研究方法和理论参考。

单病毒示踪可以实时动态高时空分辨地揭示病毒侵染的奥秘。本项目首先建立了艾滋病毒多色荧光标记和活细胞内单个病毒实时示踪分析方法，动态可视地追踪了病毒脱壳过程。利用金属钌有机配合物([Ru(phen)2(dppz)]2+)、双砷染料（FlAsH/ReAsH）、和荧光蛋白（EGFP/ECFP）分别对病毒的基因组RNA、衣壳蛋白CA和基质蛋白MA进行荧光标记，构建了具有侵染能力的双色和三色荧光标记病毒颗粒。结合单颗粒示踪技术，对单个艾滋病毒入侵宿主细胞时的解离脱壳过程进行实时、动态、可视化分析，揭示了艾滋病毒在侵染宿主细胞后60-120分钟期间，病毒基因组、衣壳蛋白和基质蛋白以一个类似于“火箭升空逐级分离”的模式动态顺序解离。发现病毒解离脱壳过程的时间和效率会受到细胞因子CypA和病毒逆转录过程的影响。该研究为国际上首次实现活细胞内单个艾滋病毒脱壳过程的实时动态解析，对深入理解艾滋病毒在宿主细胞中的生命周期具有重要意义，也将为开发新的抗病毒途径提供思路。同时，也构建了包装量子点的艾滋病毒，结合活细胞内单颗粒示踪技术，实时动态示踪了单个艾滋病毒有效侵染人原代巨噬细胞的动态过程与机制，并揭示了单个艾滋病毒侵染过程中基质层蛋白复杂的动态行为和单个病毒诱导细胞线粒体分裂的实时动态过程。并且，基于所发展的量子点标记病毒新方法，实时动态示踪了单个流感病毒的脱壳过程。相关研究成果在PNAS、Nat Commun、ACS Nano、Nano Lett等发表SCI文章8篇，国际国内重要会议邀请或口头报告10余次。